生物化学过氧化氢酶Km值测定

过氧化氢酶米氏常数的测定一、实验目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。学习一种测定酶Km值的方法熟悉和掌握过氧化氢酶活性的测定原理和方法二、相关知识与原理米氏方程与米氏常数（Km值）

米氏方程Km值:

酶促反应速度为Vmax/2时的

底物浓度。单位是mol/LＶVmax[S]Km+[S]＝──相关知识Km值的含义Km值是酶的特征性常数之一Km值可近似表示酶对底物的亲和力同一酶对于不同底物有不同的Km值测定Km是研究酶的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01∽100mmol/L之间。

双倒数作图法Vmax[S]Km+[S]V=两边同取倒数

（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]

绘制1/[S]与1/V的标准曲线，其与X轴的交点即为－1/Km，以此求得该酶在测定条件下的Km值。Km值的测定方法实验原理过氧化氢酶催化2H2O22H2O+O2↑反应一定时间后，剩余过氧化氢进行下述反应2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O用KMnO4滴定可求出反应前后H2O2的浓度差即反应的速度。用不同的H2O2的起始量代表同一体系不同时刻的底物浓度。根据不同的底物浓度和对应的反应速度绘制标准曲线。从坐标图上读出-1/Km，计算Km值。1、0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。2、0.02mol/LKMnO4：称取KMnO43.2g，加蒸馏水1000mL，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存3、0.004mol/LKMnO4：称取恒重草酸钠0.2g，加250mL冷沸水及10mL浓硫酸，用0.02mol/LKMnO4滴定至至微红色，加热至65℃，继续滴定微红色30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。三、试剂4、0.05mol/LH2O2:30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.004mol/LKMnO4

标定其准确浓度(标定前稀释4倍，取2mL，加25%H2SO42mL，用0.004mol/LKMnO4

滴定至微红色)。(标定0.05mol/LH2O2的实际浓度为0.053mol/L)5、25%H2SO4

5Na2C2O4+2KMnO4+8H2SO4=10CO2↑+2MnSO4+K2SO4+8H2O+5Na2SO4

1、酶液的制备：

每组(共分6组)称取马铃薯5g，加磷酸缓冲液10mL，研钵匀浆，滤纸过滤。四、实验步骤2、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶6只，编号后按下表操作：试剂（mL）012345H2O2溶液/mL01.001.251.672.505.00蒸馏水/mL9.58.508.257.837.004.50酶液/mL0.500.500.500.500.500.50

先加好0.053mol/LH2O2和蒸馏水，加入酶液后立即混合摇匀并计录时间，各瓶准确静置5分钟后，立即加入25%H2SO42.0mL，边加边摇，以终止酶促反应。最后用标准0.004mol/LKMnO4滴定剩余的H2O2至微红色，记录各瓶耗KMnO4的mL数。

3、实验数据收集（根据实验进程填写下表）项目012345①加入H2O2的mL数②KMnO4的用量③加入H2O2的mmol数④剩余H2O2的mmol数＝②×0.004×2.5⑤反应速度＝③－④⑥底物浓度[s]＝③÷10⑦1/v=1÷⑤÷5⑧1/[s]=1÷⑥注意事项反应瓶中H2O2浓度计算：

〔S〕＝H2O2摩尔浓度×加入H2O2的mL数

10

＝加入H2O2的摩尔数

10

＝（mmol/mL）反应速度的计算

V=加入的H2O2的毫摩尔数－剩余的H2O2的毫摩尔数/5min