MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌

MS一、实践目的通过MS把握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的一般操作技术。二、实践用具与材料PH试纸、培育瓶、标签、铅笔、量筒、烧杯、容量瓶、广口瓶、玻棒、电子天平、托盘天平、棉花、报纸等用具。硝酸铵、硝酸钾、EDTAIAA、BA等药品、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1mol/LNaOH、0.1mol/LHCL、95%酒精三、实践学时与场地10四、实践内容〔一〕三角瓶棉塞的制作棉塞的作用有：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。要求：外形，大小，松紧适度制作：〔1〕取一大小适当的纱布，将其中心铺于三角瓶口，任其自然下垂至外壁，用，剪去多余线头和纱布，棉塞制作完毕使用时，再用牛皮纸或二层报纸包扎好〔二〕培育基母液的配制母液是欲配制培育基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍的溶液。优点：〔1〕保证各物质成分的准确性。〔2〕便于配置时快速移取。〔3〕便于低温保藏。1、步骤⑴测定各类母液保存容器容量，记录。⑵依据记录设计各种母液所配浓度倍数和制培育基时取用量⑶计算各种药品所需用量⑷称量药品0.1g用托盘天平称量，微量元素等小于0.1g⑸溶解⑹定容⑺写上标签⑻装瓶将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培育基母液的名称、浓缩倍数、日期。留意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。〔9〕冰箱保存。2、母液配方MS⑴MS〔10X〕1011100ml。⑵MS微量元素母液〔100X〕10100ml110ml。留意：CoCl2·6H2O和CuSO4·5H2O100．25mgX10=2．5mg〔10025mg〕100ml1ml〔0.1ml0．25mg的量〕参与到母液中。⑶MS铁盐母液〔100X〕10100ml110ml。留意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热，并将pH调至5.5。混合时，先取一种置容量瓶〔烧杯〕中，然后将另一种成分逐加逐猛烈震荡，至产生深黄色溶液，最终定容，保存在棕色试剂瓶中。⑷MS有机物母液〔100X〕10100ml110ml。⑸生长调整剂1-5mg/ml〔0.5-1mg/ml〕，4mg/ml。溶解生长素0．5–1NNaOH(6-BA)1ML95%酒精(2，4-D和NAA)溶解，溶解分裂0．5–1N的HCl加热溶解。⒊配制培育基母液时留意事项：①某些离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶解，在按配方挨次依次混合；②配制母液时必需用蒸馏水或重蒸馏水；③药品应用化学纯或分析纯；〔三〕培育基的制备1.步骤1L培育基成分用量10X大量元素母液100ml100X微量元素母液1000XCoCl·6HO2 2母液10ml1ml·5HO母液4 2100X有机物母液10ml100X有机物母液10ml

1ml10ml琼脂10g蔗糖 琼脂10g⑵依据制作要求计算培育基各种母液的用量。3、按以下母液的挨次，用量筒或移液管提取母液，放入有确定蒸馏水的烧杯中。4、参与固化剂：称量10g琼脂，溶解，在电炉上不断加温溶液，并不断搅拌，使琼脂熔化。530g已称量蔗糖，稍加搅拌。6、参与生长调整物质，激素类型和用量视培育物不同而不同。7、定容：定容至所需升数。8PHPH试纸测试PH5.8-6.00.1mol/LHCL0.1mol/LNaOH9、培育基分注：趁热将配制好的培育基分注到培育瓶中，每瓶装入20-35ML左右的培育基。分注后马上加盖，贴上标签，注明培育基的名称和配制时间。〔四〕、灭菌1、高压蒸汽灭菌⑴包扎 用牛皮纸、纱布把玻璃器皿和金属器械包扎好。⑵装水 先在高压灭菌锅内装入确定量的水，需漂移电热丝。⑶灭菌 将装好培育基的培育皿、包扎好的玻璃器皿和金属器械、放入高压灭菌锅。压力升至49kPa时翻开排气阀排冷气关闭排气阀连续加压至108kPa,锅内温度为12-10C时，保持15-20min，关断电源，自然冷却。⑷贮藏 将培育基、器械取出置于30℃下备用。附：组培的其他灭菌方式干热灭菌⑴洗涤 将组织培育的培育皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进展彻底清洗。⑵灭菌 把洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃温度下，干热灭菌1小时，或120℃下2小时。⑶放置 灭菌完毕，待冷却后取出。紫外线消毒用于空气、操作台外表和一些不能使用其它方法进展消毒的培育器皿〔如塑料培育皿、培育板等〔1〕产生臭氧，污染空气，对身体有害；〔2〕射线照耀不到的部位起不到消毒作用，故消毒时，物品不宜相互遮挡。滤过消毒〔这些在高温下会发生变性，失去其功能，必需承受滤过法除菌。一般用液常用孔径0.22um留意：〔1〕滤膜用后丢弃，滤器清洗也比较便利，先用毛刷蘸洗涤剂刷洗干净，用自来水冲洗后，再