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文档简介
Crispr/Cas9靶向修饰培训班2015-12-18/19华普精瑞生物 技术设计sgRNA分子克隆细胞转染组DNA提取PCR鉴定理论讲解实验操作CRISPR/CAS9edGenome
EditingGenome
Editing特异性DNA识别域非特异性核酸内切酶+DNA
损伤修复系统DNA
损伤修复系统三大
编辑工具:ZFN三大
编辑工具:ZFNZFN技术应用三大 编辑工具:TALEN三大 编辑工具:TALEN三大 编辑工具:TALEN的技术特点Doudna和CharpentierGeorge
ChurchZhangFengCRISPR/CAS技术发展历史CRISPR/CAS技术发展历史2000年研究者发现这种系统在>40%的细菌中和>90%的古生菌中广泛存在。2002年这套系统第一次被命名为CRISPR
(CR
I
SP
R)。2005年重复序列来自于噬菌体且推测跟细菌和古生菌的获得性免疫有关系。2007年第一次证实Crispr的作用是获得性免疫。2008年Spacers可以转录形成crRNA起到指导Cas靶向性的作用。且Crispr的靶点是DNA。CRISPR/CAS技术发展历史Diversity
of
Cas9CRISPR/CAS概述RUVC、HNH:核酸酶结构域PI:PAM结合结构域REC:a螺旋识别结构域BH:Bridge
Helix
与RNA-DNA结合区的3端8-12nt结合Cas9的结构特点及作用机制CRISPR/CAS9
作用机制-PAM序列CRISPR/CAS9作用机制-sgRNACRISPR/CAS9作用机制CRISPR/CAS9系统改造CAS9
子优化CAS9核定位信号crRNA改造U6启动子TRansformation
of
CRISPR/CAS9CAS9
子优化CAS9核定位信号crRNA改造U6启动子TRansformation
of
CRISPR/CAS9CAS9
子优化CAS9核定位信号crRNA改造U6启动子:CRISPR/CAS9应用CRISPR/CAS9实验流程CRISPR/CAS9实验流程CRISPR/CAS9应用:
KnockoutCRISPR/CAS9应用:
KnockoutCRISPR/CAS9应用:
KnockinCRISPR/CAS9应用:Knock-inCRISPR/CAS9应用:Knock-inCRISPR/CAS9应用:Knock-in在设计HR模板时可以参考下面的建议:Cell
paper:
h
//S0092-8674(13)01015-5Knockin
strategy
via
Crispr/Cas9在设计HR模板时可以参考下面的建议:Cell
paper:h
//S0092-8674(13)01016-7CRISPR/CAS9应用: Large
fragment
deletionLarge
genomic
deletion
by
Crispr/Cas9sgRNA
1sgRNA
2sgRNA
3sgRNA
4n
kbCRISPR/CAS9应用: Transcription
repressionCRISPR/CAS9应用:Transcription
activation
or
repressionCRISPR/CAS9应用: Transcription
activationCRISPR/CAS9应用: Transcription
activationCRISPR/CAS9应用:
Genomic
labellingCRISPR/CAS9实验流程CRISPR/CAS9实验流程第一步:设计sgRNA如何设计sgRNA第一步:设计sgRNA设计软如何设计sgRNA选择sgRNA序列时要考虑两个因素:3’端PAM序列。脱靶效应。目前提供sgRNA设计的工具有很多包括件和独立的设计
,常用的设计工具List
of
CRISPR/Cas
toolsTool
Name
ProviderSearch
Returns
allSeedspanandsn
canumoflocatio
mismatcheseswholegenom
ofe
for
genoms
edefinededAvailablePnumber
rotospaceradjacent
motifbe
support
(PAM)sequencesAnnotation
isreportedgRNAsuggestionor
scoringExternal
LinksgRNADesignerBroad
Institute
NoNoNo0NGGCDS(ifsearchingby
Yestranscript
ID)WebserverSource
codeOff-SpotterThomas
Jefferso
n
Universi
tyYes
Yes
Yes
0-5NGG,
NAG,NNNNACA,NNGRRT
(Ris
A
or
G)UserWebserverSourcmRNA
exons,unspliced
mRNA,mRNA,
5'UTR,CDS,3'UTR,
eunsplicedlincRNA,
lincRNAcustomizabl
e
codegRNADesignToolDNA2.0
YesYes
No0-10NGG,
NAGGenbankannotations:Gene,misc_RNA,ncRNA,
CDS,exonYesWebserverekuctorCRISPRse
Biocond
YesYes
NoAny
Usernumber
customizablemRNA
exons
YesSource
codeCRISPRDesignZhangLab,MITYes
NoNo4NGG
andNAGmRNA
exons
YesWebserver第一步:设计sgRNA第一步:设计sgRNA第一步:设计sgRNA第一步:设计sgRNA第二步:sgRNA构建EMX1
sgRNA
获取反义链sgRNA-1.S:
5
CTCTATGGTAAAGCCGCGCT
3sgRNA-1.A:
5
AGCGCGGCTTTACCATAGAG3EMX1
sgRNA
加粘性末端sgRNA-1.S:
5
CACCgCTCTATGGTAAAGCCGCGCT
3sgRNA-1.A:
5
AAACAGCGCGGCTTTACCATAGAGc
3EMX1
sgRNA
设计sgRNA-1.S:
5
CTCTATGGTAAAGCCGCGCT
3送引物
公司
上述序列第二步:sgRNA构建退火形成粘性末端Guide
#1.S(5-3)
:caccGCTCTATGGTAAAGCCGCGCTGuide
#1.A(3-5)
:
CGAG
CATTTCGGCGCGAcaaaAnneal
in
a
thermocyclerusing
the
following
parameters:37℃
30
min95℃
5minthen
ramp
down
to
25℃
at
5℃/minsgRNA
anealing
and
phosphorylationoligo
1
(100μM)1uloligo
2
(100μM)1ul10X
T4
LigationBuffer
(NEB)1ulddH2O6.5ulT4
PNK
(NEB)0.5ulTotal10ul第二步:sgRNA构建载体线性化第二步:sgRNA构建载体线性化第二步:sgRNA构建载体线性化Digest
1ug
of
PX458
with
BbsI
for30
min
at37C:PX4581ugFastDigest
BbsI
(Fermentas)1ulFastAP
(Fermentas)1ul10X
FastDigest
Buffer2ulddH2OXulTotal20ul琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果,并用胶回收试剂盒回收线性化后的片段第二步:sgRNA构建连接第二步:sgRNA构建连接sgRNA
and
PX458
ligationBbsI
digested
pX458
from
step
2(50ng)Xulphosphorylated
and
annealedoligo
duplex
from
step
3(1:99dilution)1ul2X
Quick
ligationBuffer
(NEB)5ulddH2OXulQuick
Ligase
(NEB)1ulTotal10ul克隆 鉴定转化第三步:转染sgRNA、Cas9转染类型应用材料生物转染腺
,慢细胞,
动物等质粒载体土壤农杆菌植物质粒载体物理转染显微注射两栖类,哺乳类卵细胞质粒载体,
Cas9mRNA,蛋白,
sgRNA(PCR产物)电转染难转染的原代细胞,悬浮细胞,贴壁细胞质粒载体,Cas9mRNA,sgRNA(PCR产物)枪质粒载体,Cas9mRNA,sgRNA(PCR产物)化学转染细胞质粒载体,sgRNA(PCR产物)阳离子脂阳离子聚合物第四步:结果检测初步检测实验结果筛选方法步骤梯度稀释96孔板梯度稀释选取单细胞孔扩增鉴定克隆形成接种一定数目细胞到90mm培养皿,培养形成单克隆,并挑取扩增鉴定类型荧光流式细胞仪分选,显微镜观察Surveyor
nucleaseassay初步检测成功率抗性抗性筛选单克隆筛选CRISPR/CAS9检测方法:Surveyor
nucleaseCRISPR/CAS9检测方法:Surveyor
nuclease第五步:克隆鉴定单克隆鉴定筛选方法步骤DNA一代 ,二代 确定靶 修饰Western
blot蛋白水平确定 表达表型鉴定确证脱靶效应检测一代
检测可能脱靶位点。第五步:克隆鉴定可能脱靶位点鉴定CRISPR/CAS9:
特异性CRISPR/CAS9:
特异性CRISPR/CAS9:
特异性当远PAM端序列错配时也可能对该位点剪切。脱靶CRISPR/CAS9:
特异性TALEN
vs
CRISPR-Cas9识别原理TALEN根据一个重复单元对应一个碱基,将多个(16)重复单元串联来决定识别序列的特异性。CRISPR/Cas9依赖于crRNA或sgRNA上的20个碱基的向导序列与目的DNA,以及PAM序列决定切割位点的特异性。识别原理质粒构建T
C
A
T
C
A
G
C
T
C
A
T
G
C
A
G
G
CTALENCRISPR/Cas9TALEN比CRISPR/Cas9切割位点的特异性高。切割点的特异性TALEN切割位点的特异性由两个TALEN识别序列(各16个单元)共同决定。CRISPR/Cas9系统切割位点的特异性取决于向导序列(20bp)和PAM(NGG)序列。CRISPR/CAS9:
如何提高特异性?RUVC、HNH:核酸酶结构域PI:PAM结合结构域REC:a螺旋识别结构域BH:Bridge
Helix
与RNA-DNA结合区的3端8-12nt结合Cas9的结构特点及作用机制CRISPR/CAS9:
如何提高特异性?CRISPR/CAS9应用:
Double-nickase5’3’3’5’DSB5’3’3’5’sgRNA1#sgRNA2#5’3’3’5’SSBSSBNHEJ
or
HRCRISPR/CAS9应用:
Double-nickaseCRISPR/CAS9应用:
Double-nickasesgRNA2#SSB
repairedby
BER/NERDSB
repairedby
HR/NHEJsgRNA1#sgRNA2#sgRNA1#Off-1Off-2DNA
损伤修复系统CRISPR/CAS9应用:
specificityCRISPR/CAS9应用:
Double-nickaseCRISPR/CAS9应用:
Double-nickaseCRISPR/CAS9应用:
Double-nickaseCRISPR/CAS9应用:
Double-nickase-KICRISPR/CAS9应用:
Double-nickaseCRISPR/CAS9应用:
specificityCRISPR/CAS9应用:
Talen-CrisprdCas9-FokI:
D10A,
H840A.CRISPR/CAS9应用:Crispr/Cas9(K810A,R1003A
and
R1060A)CRISPR/CAS9
PlasmidspX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Plasmid
#42230)A
human
codon-optimized
SpCas9
and
chimeric
guideRNA
expression
plasmid.Vector
type Gene/Insert
name:Growth
in
BacteriaInsert
Size
(bp):Promoter:TagCRISPR/CAS9
PlasmidspSpCas9(BB)-2A-GFP
(PX458)(Plasmid
#48138)Cas9
from
S.
pyogenes
with
2A-EGFP,
and
cloningbackbone
for
sgRNAVector
type Gene/Insert
name:Growth
in
BacteriaInsert
Size
(bp):Promoter:TagCRISPR/CAS9
PlasmidspSpCas9(BB)-2A-Puro
(PX459)(Plasmid
#48139)Cas9
from
S.
pyogenes
with
2A-Puro,
and
cloningbackbone
for
sgRNAVector
type Gene/Insert
name:Growth
in
BacteriaInsert
Size
(bp):Promoter:TagCRISPR/CAS9
PlasmidsVector
typeGrowth
in
BacteriaGene/Insert
name:Insert
Size
(bp):Promoter:TagpSpCas9n(BB)-2A-GFP
(PX461)(Plasmid
#48140)Cas9n
(D10A
nickase
mutant)
from
S.
pyogenes
with
2A-EGFP,
and
cloning
backbone
for
sgRNApSpCas9n(BB)-2A-Puro
(PX462)(Plasmid#48141)Cas9n
(D10A
nickase
mutant)
from
S.
pyogenes
with
2A-Puro,
and
cloning
backbonefor
sgRNA
(V2.0)CRISPR/CAS9
Plasmids:
Lenti-vectorspCW-Cas9 (Plasmid
#50661)Inducible
lentiviral
expression
of
SpCas9Vector
type:Selectable
markers:Growth
in
BacteriaGene/Insert
name:Insert
Size
(bp):Promoter:TagPakagege
plasmids:CRISPR/CAS9
Plasmids:
Lenti-vectorslentiGuide-Puro
(Plasmid
#52963)Expresses
S.
pyogenes
CRISPR
chimeric
RNA
element
withcustomizable
sgRNA
from
U6
promoter
and
puromycinfrom
EF-1a
promoter.
Lentiviral
backbone.Vector
type:Selectable
markers:Growth
in
BacteriaGene/Insert
name:Insert
Size
(bp):Promoter:Pakagege
plasmids:CRISPR/CAS9
Plasmids:
Lenti-vectorslentiGuide-Puro
(Plasmid
#52963)Expresses
S.
pyogenes
CRISPR
chimeric
RNA
element
withcustomizable
sgRNA
from
U6
promoter
and
puromycinfrom
EF-1a
promoter.
Lentiviral
backbone.Gene/Insert
name:Selectable
markers:Insert
Size
(bp):Promoter:
Pakagege
plasmids:lentiCas9-Blast
(Plasmid
#52962)Expresses
human
codon-optimized
S.
pyogenes
Cas9
proteinand
blasticidin from
EFS
promoter.
Lentiviralbackbone.Gene/Insert
name:Selectable
markers:Insert
Size
(bp):Promoter:
Pakagege
plasmids:CRISPR/CAS9
Plasmids:
Lenti-vectorsLentiGuide-Puro
(Plasmid#52963)LentiCas9-Blast
(Plasmid
#52962)CRISPR/CAS9
PlasmidsFokI-dCas9
(Plasmid
#52970)Expresses
Fok1
nucleaseCas9
DNA-bindingfused
to
catalytically
inactivein
mammalian
cellsCRISPR/CAS9
PlasmidspX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::BsaI-sgRNA
(Plasmid
#61591)A
single
vector
AAV-Cas9
system
containing
Cas9
fromStaphylococcus
aureus
(SaCas9)
and
its
sgRN
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