教学课件 21动物细胞工程

如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶啦！动物细胞也能融合吗？如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要1动物细胞与组织培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植与体细胞克隆动物细胞工程常用技术动物细胞与组织培养是动物细胞工程的基础动物细胞与组织培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植与体细胞克2动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养3问题讨论烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植。问题讨论烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植4动物细胞培养阅读课本观察图片，简述动物细胞培养的基本过程？就是指在体外模拟动物体内环境，将动物细胞或组织在无菌、温度适宜和营养充足的条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术过程。动物细胞培养阅读课本观察图片，简述动物细胞培养的基本过程？就5动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液原代培养动物细胞培养部分细胞无限传代动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养10代细胞50代细胞动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制6思考讨论总结：1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。动物组织或细胞培养的容易程度：幼体组织或细胞＞老龄组织或细胞分化程度低的组织或细胞＞分化程度高的组织或细胞肿瘤组织或细胞＞正常组织或细胞思考讨论总结：1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄72.在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞;成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖.思考讨论总结：进一步思考：①.植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？②.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？③.细胞膜的主要成份是什么？胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？④.既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制;不能，因为两者最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近2.在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织83.有关概念:原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。其生物学特性未发生的大变化，最接近于体内组织或细胞的生长特性，很适合用于药物测试、基因表达等实验研究。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。3.有关概念:原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞94.动物细胞培养条件：①、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）②、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）③、温度和PH

36.5+（-）0.5度,7.2-7.4④、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）保证细胞顺利的生长增殖思考：多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体培养细胞应该模拟内环境的哪些内容呢？4.动物细胞培养条件：①、无菌、无毒的环境保证细胞顺利的生长10脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。5.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和116.动物细胞培养技术的应用:①.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体②.健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植③.细胞的生理、药理、病理研究

6.动物细胞培养技术的应用:①.蛋白质生物制品的生产12获得细胞细胞的全能性植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目7.植物细胞和动物细胞培养的比较细胞群体获得细胞细胞的全能性植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无13细胞核移植动物体细胞克隆细胞核移植动物体细胞克隆14核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）受体细胞：MⅡ期的卵母细胞1.概念：细胞核移植P42体细胞克隆P42体细胞克隆的关键是细胞核移植技术核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）受体细胞：MⅡ期的15教学课件21动物细胞工程16卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎17练习：世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊卵腺细胞核重组细胞早期胚胎另一头母绵羊子宫克隆绵羊多莉ab电脉冲处理妊娠、出生⑴写出ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ

ｂ

。⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。⑶多莉面部的毛色是

，判断依据：

。⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有

。⑸请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义：。练习：世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔18克隆动物的研究意义1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.改良动物品种3.治疗人类疾病，作为供体4.保护濒危动物体细胞核移植技术存在的问题：在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物易表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等，畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。克隆动物的研究意义1.克隆动物作为生物体细胞核移植技术在研究19思考：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？思考：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达20（1）提示：可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）提示：首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。（1）提示：可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达21教学课件21动物细胞工程22动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液原代培养动物细胞培养部分细胞无限传代动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养10代细胞50代细胞动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制23卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎242.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？1.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？提示：培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。提示：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。2.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉253.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？提示：克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供26动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体27（一）、动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用（一）、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合28动物细胞融合动物细胞融合29细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法仙台病毒30细胞融合与融合诱导细胞融合物质：诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇

诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。细胞融合技术应用于哪些方面？细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。是研究细胞间遗传信息的转移，染色体上基因的定位等的有效途径。细胞融合与融合诱导细胞融合物质：诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇

31已成功的动物细胞融合实例生物种类细胞来源成功年代酵母菌—鸡原生质体—血红细胞1975年人—胡萝卜腹水癌细胞—原生质体1976年人—小鼠纤维肉瘤细胞—畸胎瘤细胞1978年已成功的动物细胞融合实例生物种类细胞来源成功年代酵母菌—鸡原32教学课件21动物细胞工程33（二）、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。（二）、单克隆抗体什么是抗体？34B淋巴细胞与抗体的关系：

１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。３．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？B淋巴细胞与抗体的关系：１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以35单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：特异性强、纯度高、灵敏度高、产量大、容易标准化生产。

单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基36如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何筛选？融合方式？如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能如何筛选？37单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融38教学课件21动物细胞工程39单克隆抗体的制备注入小鼠细胞融合分离抗原注入小鼠体内B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞培养基体内培养体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体能产生的特定抗体

能在体外培养条件下大量增殖在灭活的仙台病毒或

聚乙二醇的诱导下融合单克隆抗体的制备注入小鼠细胞融合分离抗原注入小鼠体内B淋巴40思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体.融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物41单克隆抗体的应用

1、单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。2、人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。

资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。单克隆抗体的应用1、单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面42植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞膜的流动性细胞融合的方法去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物43小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高的优势小结两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个44

练习：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。1、该实验方案的目的是__________3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段，其中_____代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体B细胞抗体细胞融合灭活病毒双亲细胞分泌抗体无限增殖原代传代50B体外培养骨髓瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群注射到小鼠腹腔AC练习：下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风451.动物细胞工程技术的基础是：（）A．动物细胞融合 B．胚胎移植C．动物细胞培养D．核移植Ｃ1.动物细胞工程技术的基础是：（）Ｃ46２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A．结果是相同的

B．杂种细胞的形成过程基本相同C．操作过程中酶的作用相同D．诱导融合的手段相同Ｂ２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）47３.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）①淋巴细胞②小鼠骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．②④B．①③⑤C．①②③④D．②③C３.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞C48再见再见49教学课件21动物细胞工程50动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液原代培养动物细胞培养细胞增殖部分细胞无限传代去掉组织间蛋白动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制513、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）3、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮52思考下列问题：1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？思考下列问题：1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细53如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶啦！动物细胞也能融合吗？如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要54动物细胞与组织培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植与体细胞克隆动物细胞工程常用技术动物细胞与组织培养是动物细胞工程的基础动物细胞与组织培养动物细胞融合单克隆抗体技术核移植与体细胞克55动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养56问题讨论烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人？取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植。问题讨论烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植57动物细胞培养阅读课本观察图片，简述动物细胞培养的基本过程？就是指在体外模拟动物体内环境，将动物细胞或组织在无菌、温度适宜和营养充足的条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术过程。动物细胞培养阅读课本观察图片，简述动物细胞培养的基本过程？就58动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液原代培养动物细胞培养部分细胞无限传代动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养10代细胞50代细胞动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制59思考讨论总结：1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。动物组织或细胞培养的容易程度：幼体组织或细胞＞老龄组织或细胞分化程度低的组织或细胞＞分化程度高的组织或细胞肿瘤组织或细胞＞正常组织或细胞思考讨论总结：1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄602.在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞;成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖.思考讨论总结：进一步思考：①.植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？②.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？③.细胞膜的主要成份是什么？胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？④.既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？注意时间的控制;不能，因为两者最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近2.在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织613.有关概念:原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。其生物学特性未发生的大变化，最接近于体内组织或细胞的生长特性，很适合用于药物测试、基因表达等实验研究。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。3.有关概念:原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞624.动物细胞培养条件：①、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）②、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）③、温度和PH

36.5+（-）0.5度,7.2-7.4④、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）保证细胞顺利的生长增殖思考：多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体培养细胞应该模拟内环境的哪些内容呢？4.动物细胞培养条件：①、无菌、无毒的环境保证细胞顺利的生长63脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。5.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和646.动物细胞培养技术的应用:①.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体②.健康细胞培养培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植③.细胞的生理、药理、病理研究

6.动物细胞培养技术的应用:①.蛋白质生物制品的生产65获得细胞细胞的全能性植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目7.植物细胞和动物细胞培养的比较细胞群体获得细胞细胞的全能性植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无66细胞核移植动物体细胞克隆细胞核移植动物体细胞克隆67核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）受体细胞：MⅡ期的卵母细胞1.概念：细胞核移植P42体细胞克隆P42体细胞克隆的关键是细胞核移植技术核移植胚胎细胞核移植体细胞核移植（难度高）受体细胞：MⅡ期的68教学课件21动物细胞工程69卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎70练习：世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔细看图后回答问题：黑面绵羊去核卵细胞白面绵羊卵腺细胞核重组细胞早期胚胎另一头母绵羊子宫克隆绵羊多莉ab电脉冲处理妊娠、出生⑴写出ａ、ｂ所指的细胞工程各称：ａ

ｂ

。⑵实施细胞工程ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是：。⑶多莉面部的毛色是

，判断依据：

。⑷继植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物细胞也具有

。⑸请举例说明克隆绵羊培育成功的实际意义：。练习：世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。请仔71克隆动物的研究意义1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.改良动物品种3.治疗人类疾病，作为供体4.保护濒危动物体细胞核移植技术存在的问题：在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物易表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等，畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。克隆动物的研究意义1.克隆动物作为生物体细胞核移植技术在研究72思考：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？思考：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达73（1）提示：可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。但同时需注意，该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。（2）提示：首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。（1）提示：可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达74教学课件21动物细胞工程75动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制成细胞悬浮液原代培养动物细胞培养部分细胞无限传代动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养10代细胞50代细胞动物胚胎或幼龄动物的组织、器官胰蛋白酶剪碎单个细胞加培养液制76卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎772.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？1.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？提示：培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。提示：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。2.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉783.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？提示：克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。所以，用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供79动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体80（一）、动物细胞融合

细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合受精作用（一）、动物细胞融合细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合81动物细胞融合动物细胞融合82细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法化学法仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒物理法仙台病毒83细胞融合与融合诱导细胞融合物质：诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇

诱导细胞融合的仙台病毒必须灭活。思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。细胞融合技术应用于哪些方面？细胞学、遗传学、免疫学及制备单克隆抗体。是研究细胞间遗传信息的转移，染色体上基因的定位等的有效途径。细胞融合与融合诱导细胞融合物质：诱导剂：仙台病毒、聚乙二醇

84已成功的动物细胞融合实例生物种类细胞来源成功年代酵母菌—鸡原生质体—血红细胞1975年人—胡萝卜腹水癌细胞—原生质体1976年人—小鼠纤维肉瘤细胞—畸胎瘤细胞1978年已成功的动物细胞融合实例生物种类细胞来源成功年代酵母菌—鸡原85教学课件21动物细胞工程86（二）、单克隆抗体什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。（二）、单克隆抗体什么是抗体？87B淋巴细胞与抗体的关系：

１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。２．动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。３．每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？怎样解决这个问题？B淋巴细胞与抗体的关系：１．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以88单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

特点：特异性强、纯度高、灵敏度高、产量大、容易标准化生产。

单克隆抗体由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基89如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞如何筛选？融合方式？如何大量生产单克隆抗体？利用淋巴细胞产生抗体的功能如何筛选？90单克隆抗体制备过程

注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选，继续培养足够数量的、能产生特定抗体的细胞群体外培养注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体制备过程注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞细胞融91教学课件21动物细胞工程92单克隆抗体的制备注入小鼠细胞融合分离抗原注入小鼠体内B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞培养基体内培养体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体能产生的特定抗体

能在体外培养条件下大量增殖在灭活的仙台病毒或

聚乙二醇的诱导下融合单克隆抗体的制备注入小鼠细胞融合分离抗原注入小鼠体内B淋巴93思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体.融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？思考：1、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物94单克隆抗体的应用

1、单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高，优越性非常明显。2、人们正在研究用单克隆抗体治疗癌症，就是在单抗上连接抗癌药物，制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞，又不会伤害健康细胞。

资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，