β-葡萄糖苷酶的分离纯化

本章以裂褶菌DS1液体发酵粗酶液为研究对象，对粗酶液中 伊葡萄糖甘酶先后进行硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Sephacry1S-200分子筛层析等方法对其进行分离纯化，并在此基础上对该酶的一般性质进行研究。4.1材料与方法4.1.1材料菌种:裂褶菌(S.communeDS1,由华中科技大学生命科学与技术学院资源与环境微生物所提供培养基:斜面培养基(PDA培养基)：马铃薯(200g),蔗糖(20g),琼脂(30g)，水(1000mL)种子培养基(PDY培养基)：马铃薯(200g),蔗糖(20g),水(1000mL)发酵培养基：纤维素(3.2g),蛋白陈(3.0g),KH2P04(0.2g),Ca(NO3)2.4H2O(1.5g),MgSO4.7H2O(0.5g),水(100mL)缓冲溶液0.2mol/LpH=8.10Tris-HCL缓冲溶液：称取 6.055gTris溶于500mL双蒸水中；量取4.2mL盐酸溶液溶于 500mL双蒸水中；将 262mL盐酸溶液和500mL双蒸水(含Tris)混合即成0.2molpH=8.10Tris-HCl缓冲溶液。试剂:Sigma公司Sigma公司AmershamSigma公司Sigma公司Amersham公司Amersham公司北京奥博星生物技术有限责任公司上海实验试剂有限公司Fluka公司北京鼎国生物技术发展中心中国医药 (集团)上海化学试剂公司对硝基酚( NPG)DEAE-SepharoseFastFlow

Sephacry1S-200蛋白胨硫酸铵过硫酸按考马斯亮蓝 R-250，G-250丙烯酞胺、甲叉双丙烯酞胺TEMEDPMSFSigmaTEMEDPMSFSigma公司

SDSTris甘氨酸甲硫氨酸低分子量标准蛋白PEG-20000快速银染试剂盒产丁（>95^）槐角苷（90％）槐角提取物（10：1）仪器TG-332A微量分析天平低速大容量离心机电泳仪（DYY-m型）UV2000紫外-可见光分光光度计Sigma公司上海伯奥生物科技有限公司SigmaSigma公司上海伯奥生物科技有限公司Sigma公司上海伯奥生物科技有限公司天根生化科技（北京）有限公司天津市科密欧实验化学试剂开发中心碧云天生物技术研究所国药集团化学试剂有限公司实验室自制西安天园生物技术有限公司上海天平仪器厂上海精密仪器仪表有限公司北京六一仪器厂尤尼柯 （上海）仪器有限公司粗酶液的获得方法将菌种DS1接种到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌块接入PDY培养基中，培养3d制备一级液体种，再以10％的接种量接入 PDY培养基中培养 3d制备二级液体种。按 10%的接种量将二级种加入含有 100mL发酵培养基中，于27C,150r/min摇床上培养。每天取一瓶发酵液在4000r/min条件下离心10min后，取上清液在标准条件下用pNPG测定&葡萄糖甘酶的活性。如此持续取三角瓶内的培养液直至培养的第10d为止，取&葡萄糖甘酶的活性最高的培养液为粗酶液。对硝基酚标准曲线的绘制见方法。-蒂陶糖甘酶酶活测定对硝基酚-3■葡萄糖甘（pNPG）法［54］测定&葡萄糖甘酶酶活。蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G250法。将测试酶液稀释到一定浓度，取0.5mL于试管中再加入2.5mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀，静置10min后，在595nm条件下进行

蛋白质含量测定。以牛血清蛋白做标准曲线为 Y=4.905X-0.0131,R2=0.9928(Y为吸光值，X蛋白质含量)。硫酸俊分级沉淀、脱盐和浓缩.确定盐析时饱和度范围(1)取粗酶液7份，每份15mL;(2)分别用饱和度为20%-80%相对饱和度的(NH4)2SO4于4c盐析12h;(3)以不加硫酸俊的酶液为对照，于冰箱中于4c盐析12h;8500r/min于4c离心20min;(5)分别收集各离心管中的上清液和沉淀，并用 pH5.0的乙酸-乙酸钠恢复至原体积，在A595与A410条件下分别测定其蛋白质含量和 伊葡萄糖甘酶活力。.最佳pH条件下盐析(1)在100ml粗酶液中缓慢加入硫酸俊至Xi%饱和度；4c静置12h;4C,8500r/min条件下离心20min,取上精液，测量上清液体积；(4)在上清液中继续缓慢加硫酸俊至X2%饱和度；4c静置12h;4C,8500r/min条件下离心20min,取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙酸-乙酸钠中。并在相同的缓冲溶液中透析过夜，直至检测不出 SO42+为止,4500r/min离心15min,取上清。DEAE-SepharoseF.F.阴离子交换柱层析将收集的上清液施于经Tris-HCL缓冲液(pH=8.10,50mmolTris-HCL缓冲溶液)预平衡的DEAE-SepharoseF.F.层析柱上(1.0cmx20cm),酶蛋白先用约5倍柱体积的缓冲液洗脱至A595不变后，再用300mLpH=8.10,50mmol和300mL含1mol/LNaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min,5min收集1管。将每管在标准条件下进行活性测定，收集代葡萄糖甘酶酶活性较高的洗脱液。SephacrylS-200®胶过滤层析将上步所收集的酶液用聚乙二醇 (PEG)包埋法将酶液浓缩至 2mL,进行Sephacry1S-200#胶过滤层析(1.6cmx76cm),用pH=8.10,50mmolTris-HCI缓冲液洗脱，流速为0.4mL/min,5min收集1管。进行活性测定后收集具有酶活性的洗脱液部分，对其进行SDS(SDS聚丙烯吹胺凝胶电泳)确认纯度。SDS电泳溶液及胶的配制表4.1SDS电泳溶液及胶的配制名称配制方法保存条件

名称配制方法保存条件A液凝胶浓度30%,交联度2.67%丙烯酰胺3.00g双丙烯酰胺0.08g加双蒸水定容至5.0mL4cB液1.5MpH=8.8Tris-HCl缓冲溶液4c（分离胶缓冲溶液）Tris18.2g1MHCl调节pH至8.8双蒸水定容至100mLC液0.5MpH=6.8Tris-HCl缓冲溶液4c（浓缩胶缓冲溶液）Tris1.8g1MHCl调节pH至6.8双蒸水定容至30mL聚合起始剂10%过硫酸俊0.5g过硫酸俊，加5mL双蒸水溶解室温，现配现用聚合促进剂TEMED4c电泳缓冲液Tris9.0g甘氨酸43.2gSDS3g加双蒸水至600mL4c样品溶解液0.5MpH=6.8Tris-HCl3.0mL甘油 2.4mLSDS 0.48g&毓基乙醇 1.2mL0.5%(W/V)澳酚蓝 1.2ml共计 8.0mL4c染色液考马四亮蓝R-250 0.125g甲醇 113.5mL冰乙酸 23mL加去离子水至250ml室温脱色液甲醇 25mL冰乙酸 37.5mL加去离子水至 500mL室温表4.2分离胶和浓缩胶的配制胶溶液分离胶(8%)浓缩胶(5%)A液5.3mL1.7mLB液7.6mL/C液/1.25mL10(W/V)SDS0.2mL0.1mL聚合起始液0.2mL0.1mL聚合促进剂12仙L10mL双蒸水6.7mL6.8mL共计20mL10mL0电泳具体操作步骤(l)将配制好的8%的分离胶溶液混合均匀，然后将凝胶溶液迅速倾入制胶玻璃板中，至胶液面距玻璃板凹槽3cm左右，然后在胶面上轻轻铺注1cm高的水层，垂直放置胶板，待胶凝聚后，用滤纸轻轻吸出胶面上的水，注意不要破坏胶面。(2)将配制好的5%浓缩胶迅速注入到分离胶的上层，至液面与玻璃板的凹槽平齐，插入梳子后，在室温下放置20-30min,待其完全凝聚后，小心拔出梳子并倒入电极缓冲液。(3)将蛋白样品加入等体积的样品缓冲液，混匀后在沸水中煮 3-5min,冷却后用微量进样器将其加入上样孔中。⑷将电泳槽与电泳仪相连，保持150V的恒定电压进行电泳，直至样品中染料迁移接近至下端时关闭电压，停止电泳。蛋白质的染色及脱色.固定：电泳结束后，取凝胶放入约100mL固定液中，在摇床上室温摇动20min,摇动速度为60-70r/min。固定40min以上甚至过夜可以进一步降低背景。固定液的配制：依次加入50mL乙醇、10mL乙酸和40mLMilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100mL固定液。.30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100mL30%乙醇，在摇床上室温摇动10min,摇动速度为60-70r/min。30%乙醇的配制：70mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入30mL乙醇，混匀后即成100mL30%乙醇。.水洗涤：弃30%乙醇，加入200mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10min,摇动速度为60-70r/min。.增敏：弃水，加入100mL银染增敏液(1X),在摇床上室温摇动2min,摇动速度为60-70r/min。银染增敏液(1X)的配制：99mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入1mL银染增敏

液（100X）,混匀后即为银染增敏液（IX）。银染增敏液（1X）配制后需在2h内使用。.水洗涤（共2次）：弃原有溶液，加入200mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1min,摇动速度为60-70r/min。弃水，再加入200mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1min,摇动速度为60-70r/min。.银染：弃水，加入100mL银溶液（1X）,在摇床上室温摇动10min,摇动速度为60-70r/min。银溶液（1X）的配制：99mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入1mL银溶液（100X）,混匀后即为银溶液（IX）。银溶液（1X）配制后需在2h内使用。.水洗涤：弃原有溶液，加入100mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5min,摇动速度为60-70r/min。注意：水洗涤的时间不能超过1.5min。.显色：弃水，加入100mL银染显色液，在摇床上室温摇动 3-10min,直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70r/min。银染显色液的配制：90mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入10mL银染基本显色液（10X）,再加入0.05mL银染显色加速液（2000X）,混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在20min内使用。.终止：弃银染显色液，加入100mL银染终止液（1X）,在摇床上室温摇动10min,摇动速度为60-70r/min。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。银染终止液（1X）的配制：95mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入5mL银染终止液（20X），混匀后即为银染终止液（1X）。银染终止液（1X）配制后宜当d使用。.水洗涤：弃银染终止液，加入100mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5min,摇动速度为60-70r/min。.保存：可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。SDS测定蛋白质含量（1）按4.1.4进行凝胶电泳（2）迁移率的计算和标准曲线的制作用直尺分别测量各蛋白质区带中心与凝胶顶端的距离。各蛋白质样品区带的迁移率（以相对迁移率Rf表示）按下列公式进行计算：相对迁移率蛋白质移动距离染色前胶长（Rf相对迁移率蛋白质移动距离染色前胶长（Rf）= 染色后胶长父染料移动距离以各标准蛋白质样品迁移率作横坐标，蛋白质分子量的自然对数值为纵坐标作图，即可得到一条标准曲线。（3）分子量测定测得待测蛋白质的迁移率后，由标准曲线上即可查得其分子量的自然对数值，再换算成分子量即可。2葡萄糖苷酶性质的研究（一）伊葡萄糖甘酶最佳反应温度将酶液分别在不同的温度下 （30℃，40℃， 50℃， 60℃，70℃， 80℃），测定&葡萄糖甘酶的活性，将最高的酶活力定义为 100%,分别计算不同温度条件下伊葡萄糖甘酶的剩余酶活性（采用相对酶活性来表示，即在不同温度条件下的剩余的酶活性占其中酶活性的最高值的百分比）。（二）伊葡萄糖甘酶最佳反应pH将酶液分别置于不同pH值（3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0）的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液中进行反应，并测定剩余的酶活性。将最高的酶活力定义为 100%，分别计算不同pH值条件下&葡萄糖甘酶的剩余酶活性（方法同上）。（三）伊葡萄糖甘酶的热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下 （40℃， 50℃， 60℃， 70℃， 80℃）保温不同的时间（10min,20min,30min,40min,50min,60min）后，将其迅速放置于冰水浴中，然后测定剩余的酶活性。将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下伊葡萄糖甘酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。（四）不同金属离子对&葡萄糖甘酶活性的影响在&葡萄糖甘酶与其底物进行反应时，分别加入不同的金属离子 （Cu2+,Mg2+,Co2+,Na+,Zn2+,Ba2+,Mn2+,K+,Al3+,Fe3+,Fe2+,Hg2+并使金属离子的最终浓度为 0.05mol/L，以不加金属离子的反应体系中的酶活性定义为100%,分别测定加入金属离子后各反应体系中 伊葡萄糖甘酶的剩余相对酶活性。（五）伊葡萄糖甘酶对不同物质的作用能力在标准反应条件下，用浓度为10mg/mL的不同物质，如槐角苷、染料木苷和产丁与&葡萄糖甘酶进行反应，并用HPLC对变化前后的成分进行检测。观测&葡萄糖甘酶对不同物质的作用能力。槐角苷转化体系的洗脱条件：见方法 。产丁转化体系的洗脱条件[59]:色谱柱：HypersilC-18反相柱（100mrK4.6mmi.d.;5 山m;流动相甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）:0~20min（B:67~67）;20~25min（B:67~62）;25~60min（B:62~62）;60~65min（B:62~67）;进样量：10L;流速：1.0mL?min-1;柱温：25C;检测波长355nm.4.2结果与分析不同培养时间对产生 伊葡萄糖甘酶的影响图4.1不同培养时间对产伊葡萄糖甘酶的影响从图4.1可知，不同培养天数里，裂褶菌DS1分泌,葡萄糖甘酶有很大差异。随着培养时间的增加，伊葡萄糖甘酶的分泌量成上升趋势，从第1d的0.01U/mL升高到第8d时的酶活最高值，为0.207U/mL;此后伊葡萄糖甘酶分泌量减少，酶活逐渐降低，在第12d时酶活为0.06U/mL。从上可知，摇瓶条件下，裂褶菌S.communeDS1产&葡萄糖甘酶的最佳时间是第8d。在培养的早期，裂褶菌通过利用培养基中的速效碳源得到生长， 此时由于速效碳源浓度较高，伊葡萄糖甘酶的分泌收到抑制；随着培养的进行，裂褶菌逐渐将速效碳源耗尽，此时不得不通过分泌纤维素酶将培养基中的纤维素降解。 纤维素酶分泌量的提高，使得,葡萄糖甘酶酶量也得到提高，在第8d时达到最高值。随后，随着可利用碳源的枯竭，裂褶菌的生长受到抑制，并且出现自溶现象，此时代葡萄糖甘酶酶活逐渐降低。硫酸俊分级沉淀0 1 10 1 1 ' 1 1 1 '——020%30%40%50%60%70%80%硫酸镂浓度■3-葡萄糖甘酶♦蛋白质0208O14A64oO21,8,6,421oooO5-M5A图4.2狗萄糖甘酶硫酸俊盐析曲线从图4.2可知，随着硫酸俊饱和浓度的增加，3■葡萄糖甘酶逐渐盐析出来。在饱和浓度为60%〜80%范围内盐析所得沉淀的,葡萄糖甘酶酶活和总蛋白质得率明显增加，前者从0.031U/mL升高到0.078U/mL,后者从41%升高到100%，因此，可确定,葡萄糖甘酶在粗酶液中的硫酸俊盐析范围是 60%到80%饱和度。DEAE-SepharoseF.F.阴离子交换柱层析将收集的上清液施于经 pH=8.10,50mmol/LTris-HCl缓冲溶液预平衡的DEAE-SepharoseF.F.层析柱上(1.0cmx20cm),酶蛋白先用约100mL柱体积的缓冲液洗脱至A595不变后，再用300mLpH=8.10,50mmol/LTris-HCl缓冲溶液和300mL含1mol/LNaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min,5min收集1管。将每管在标准条件下进行活性测定，收集,葡萄糖甘酶酶活性较高的洗脱液。2[-20.42[-20.4图4.3DEAE-SepharoseFastFlowK离子交换柱层析图谱从图4.3可知，酶液经在DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换柱层析后，共洗脱出3个蛋白峰(I-1,I-2,I-3)。用所述方法对各蛋白峰进行伊葡萄糖甘酶酶活的测定，结果表明峰I-3处有很强的,葡萄糖甘酶，而峰I-1和I-2处则酶活较低。收集第36管到44管的洗脱液进行下一步的分离纯化。SephacrylS-200S胶过滤层析图4.4Sephacry1S-20吩子筛层析图谱将经DEAE-SepharoseF.F.阴离子交换柱层析后的酶液用PEG-20000浓缩后，吸取2mL酶液施于经pH=8.10,50mmol/LTris-HCI缓冲液平衡的Sephacry1S-200凝胶过滤进行层析，流速为0.4mL/min,5min收集一管(前20mL未收集)。从图4.4可知，在Sephacry1S-2008胶过滤层析过程中，共洗脱出4个蛋白峰，其中峰II-1和II-4比较明显，但是没有,葡萄糖甘酶酶活存在。只有峰II-3具有

较高的,葡萄糖甘酶活性。收集峰II-3处的洗脱液（35-41管），用PEG-20000浓缩后进行SDS检测，确认其纯度。伊葡萄糖甘酶纯化过程总表整个纯化过程的结果如图4.5所示。从该图可知，,葡萄糖甘酶相对于粗酶液（100mL）已被纯化了17.8倍，从酶的酶活力由最初的0.17U/mg提高到了3.1U/mg。表4.5前萄糖甘酶纯化过程总表分离步骤总蛋白总酶活比酶活纯化倍数得率stepTotalTotalSpecificPurificationRecoverproteinactivityactivityfactory(mg)(U10-3)-1 -3(U/mg1103)(%)发酵液270.0471001701100盐析30.4256008404.854.0DEAE-Sepharose10.31560015008.733.1F.F.Sephacry1S-2001.324100310017.88.7-葡萄糖甘酶性质研究蛋白质纯度鉴定用SDS电泳对经过Sephacry1S-200s胶层析的蛋白质进行纯度鉴定,见图4.5所示。由图可知，经过Sephacry1S-200凝胶层析后出现一条带，说明所分离的代葡萄糖甘酶达到了较高的纯度。

117,00090,000[-glucosidase49,000[-glucosidase34,00025,00019,0001.标准蛋白质及分子量2.经SephacrylS-200®胶层析的代葡萄糖甘酶图4.5勖萄糖甘酶的SDS电泳图分子量测定根据实验绘制的标准蛋白质分子量对数值和相对迁移率做图4.6,线性回归后得到的LgMr-Rf标准曲线方程为y=-1.1073x+5.3246,R2=0.9845（y=蛋白质分子量的对数值，x=蛋白质的相对迁移率）。&葡萄糖甘酶经SDS分析后Rf值=0.62,由此可推出其分子质量是43.2kDa。表4.3标准蛋白的迁移率标准蛋白分子量（kDa）RfstandardproteinMolecularweight小乳糖甘酶^galactosidase1170.278兔磷酸化酶BRabbitphosphorylaseb900.322鸡卵白蛋白Ovalbumin490.533碳酸酊酶Caibonicanhydrase340.678代乳球蛋白f-lactoglobulin250.867溶菌醐Lysozyme190.956

5.25.2图4.6SDS电泳测定代葡萄糖甘酶分子量伊葡萄糖甘酶最佳反应温度将&葡萄糖甘酶置于不同温度下进行酶活测定， 结果如图4.5所示。从该图可知，伊葡萄糖甘酶的最适反应温度为50Co,ooQ。,ooQ。O08642^1为性活对相0 1 1 1 1 1 1 120 30 40 50 60 70 80 90温度（图4.5温度对3■葡萄糖甘酶活性的影响-郁萄糖甘酶最佳反应pH将&葡萄糖甘酶置于不同pH的磷酸缓冲液中进行酶活测定，结果如图 4.6所示。从图4.6可知，&葡萄糖甘酶的最适反应pH为5.0-6.0。图4.6pH对代葡萄糖甘酶活性的影响图4.6pH对代葡萄糖甘酶活性的影响-郁萄糖甘酶的热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下(40C,50C,60C,70C,80C)保温不同的时间(10min,20min,30min,40min,50min,60min)后，将其迅速调至酶的最适温度，然后测定剩余的酶活性。结果如图4.7所示，在pH值为5.0的条件下，该酶在40c和50c时活性是稳定的，酶活没有损失；在60c时，酶的半衰期是5min；在70c和80c保温10min时，相对酶活性变成3.5%。00%1活酶对相一.—40c 50c 60c 70c 80c806000%1活酶对相一.—40c 50c 60c 70c 80c806040oO2图4.7,葡萄糖甘酶的热稳定性金属离子对伊葡萄糖甘酶酶活的影响实验结果见表4.1,从表中可以看出Fe2+对酶有强烈的抑制作用，当反应体系中浓度为50mmol/L时，酶活儿乎被全部抑制；Zn2+、K+、Cu2+和A产对酶的抑制性仅次于Fe2+,在浓度为50mmol/L时，酶活分别被抑制成16%、12.8%、10.1%和13.5%;Fe3+对&葡萄糖甘酶有一定的抑制作用，而其它金属离子，如 Mg2+、Co2+、Na+、Ba2+、Mn2+和Hg2+对酶活无明显的影响。表4.1金属离子对伊葡萄糖甘酶活性的影响化学试剂浓度相对酶活力ChemicalConcentrationRelativeactivity(mmol/L)(%)对照/100Cu2+5010.1Mg2+5097.0Co2+5084.8+Na50100Zn2+5016.0Ba2+5095.3Mn2+50100K+5012.8

一一3+Al5013.53+Fe5060.72+Fe507.62+Hg50100酶水解pNPG动力学常数由米氏方程推出1/V=Km/(Vmax*1/[S])+1/Vmax,按Lineweaver-Burk法作图(4.8)。线性回归后得到方程：y=2.7974x+0.3075(R2=0.999,x为底物浓度的倒数，y为反应速度的倒数)。直线在横轴上的截距为-1/Km,纵轴上的截距为1/Vmax。由此可以得到Km为9.10mmol/L,Vmax为3.25U/L。说明该酶对pNPG有很强的亲和力，用pNPG为底物测定酶的活力是合适的。图4.8-葡萄糖甘酶催化水解pNPG的Lineweaver-Burk双倒数关系图-郁萄糖甘酶对不同底物的作用在标准反应体系下，,葡萄糖甘酶对槐角昔的转化情况如图 4.9所