第4章-抗体制药-第1、2、3节课件

第四章

抗体制药

单克隆抗体技术细胞培养技术

分子克隆克隆技术细胞克隆

动物克隆重组DNA技术蛋白质工程技术

生物传感器组织工程技术生物芯片技术生物信息学技术生物技术的范围杂交技术生物制药研究的几个热点领域抗体药物研究组合生物合成技术研究血管抑制剂抗肿瘤药物研究功能基因组学研究EGF第一节概述

1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素,建立了血清疗法,开创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、α、β、γ球蛋白，并证明抗体活性主要存在于γ球蛋白组分。

抗体是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。

抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。

多克隆抗体：病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（monoclonalantibodyMcAb）。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制备和应用提供了全新的手段，还促进了基础和临床医学的发展。

单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。

单克隆抗体用于临床治疗，CD3单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。第二节单克隆抗体

单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。杂交瘤技术的实验原理及其操作演示

接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡——短命细胞一、杂交瘤技术产生的3个技术关键1.B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(Blymphocytes)：骨髓瘤细胞(myelomacells):恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活——长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株——没有抗体分泌物。2.细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命Köhler和Milstein,19751984年Nobel医学奖3.杂交瘤细胞的筛选：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活HAT培养基筛选H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶DNA内源性途径(主要途径)谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶AHT外源性途径(旁路途径)(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)胸腺嘧啶激酶(TK)(Thymidinekinase)B淋巴细胞：HGPRT+，

TK+骨髓瘤细胞：HGPRT-，

TK-存活死亡外源性途径(旁路途径)二、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：目的：在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞.特定目标抗原动物免疫脾脏中B淋巴细胞B淋巴细胞大量增殖刺激能分泌针对于该抗原的特异性抗体常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法常用免疫方法：“稳妥；优势克隆”皮下注射腹腔注射静脉注射免疫途径：“省时；省抗原”“省时”“操作繁琐”常规免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂第3次免疫：抗原+不加佐剂第4次免疫：抗原+不加佐剂(皮下注射或静脉注射)(皮下注射)(皮下注射)(静脉注射)二、细胞融合及HAT筛选病毒介导的细胞融合PEG介导细胞融合电激融合1、细胞融合方法：细胞悬液的制备与融合(1)脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备

(2)骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备(3)细胞融合：50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1min2、HAT培养基的筛选融合后细胞混合液HAT培养基2weekslaterHT培养基正常培养基1weeklater三、抗体的检测要求：简便、快速、敏感;

在短时间内能检测大量样品常用方法：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)间接免疫荧光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)双相扩散法酶联免疫吸附法(ELISA)抗原第1抗体酶第2抗体待检杂交瘤培养上清液底物有色产物酶标仪检测技术原理：四、克隆化常用克隆化方法：有限稀释法软琼脂平板法显微操作法80个细胞/96孔饲养细胞(feedercells)ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。由单一克隆的杂交瘤细胞分泌的抗体，只针对于一个抗原决定簇——单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体(monoclonalantibody,MAb)单克隆抗体优点：高度纯一高度专一应用：疾病的论断和治疗(生物导弹)生物大分子的鉴定、定位和分离纯化细胞器的鉴定、定位和分离特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离五、大规模培养——批量生产单克隆抗体常用的大规模培养方法：动物接种法转瓶培养法细胞培养罐法培养上清中X抗体的检测克隆化培养单克隆杂交瘤细胞培养上清中X抗体的检测杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体规模化培养获得大量单克隆抗体动物免疫细胞融合混合细胞的HAT筛选)分泌X抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞X抗原B淋巴细胞瘤的突变株培养数天后细胞死亡无限生长细胞分泌X抗体只有杂交瘤细胞可长期存活下来BALB/c杂交瘤技术操作流程图解洗脱液支持物被分离物质被分离物的抗体其它物质亲合层析原理图解一、抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。

为使杂交瘤细胞稳定，免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。

免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法。

体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔10个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。7可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。脾内免疫法即在麻醉下直接将0.1～0.2ml抗原注入脾脏进行免疫。细胞抗原需105个，可溶性抗原需10μg。

体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下，如制备人源性单克隆抗体；免疫源性极弱，易引起免疫抑制。优点：需抗源量少，免疫期短，干扰因素少。体外免疫法：用4～8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5～5μg/ml,在5%CO37C下培养4～5天,再分离脾细胞,进行细胞融合。o2o二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合的方法：脾细胞（1×10）骨髓瘤细胞（2×10）混合聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。87

用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。PEG相对分子量4000，浓度为50%二甲基亚砜增加融合率。细胞融合后可产生多种融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合细胞。选择性培养:培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。A阻断DNA合成。三、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。ELISA用于破伤风抗体的筛选四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。单抗进行Ig类和亚类鉴定：用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或ELISA鉴定。亲和力、特异性、纯度、分子量测定。五、单克隆抗体的大量制备体外培养法可获的10μg/ml抗体体内诱生法可获的5～20mg/ml抗体用BALB/c小鼠。降植烷接种杂交瘤细胞取腹水离心上清。六、单克隆抗体的纯化依单抗IgG类和亚类不同，选各种不同的纯化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法：1离心取上清，超滤，盐析。2分离⑴凝胶过滤用于IgGIgM单抗纯化。⑵阴离子交换层析IgG单抗纯化。⑶亲和层析IgG单抗纯化。第三节鼠源性单克隆抗体

的改造杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。

目的：

降低免疫源性；降低相对分子量。方式：

鼠源MCAb的Ｃ区被人Ｉｇ的Ｃ区置换（人-鼠嵌合抗体、改形抗体）只克隆Ｖ区基因，使其表达（小分子抗体）Ig分子结构FabFvIg分子的基因结构一、人鼠嵌合抗体抗原抗体结合功能—抗体可变区（V）同种性免疫源性—抗体稳定区（C）在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。二、改形抗体（CDR移植抗体）Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其它部分称框架区。用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。问题：改形抗体亲和力下降，甚至活性丧失．由于Ｉｇ分子中一些氨基酸与鼠Ｉｇ的CDR不协调解决方法：摸板替换，表面重塑，补偿变换，定位保留三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段，相对分子量为原抗体的1/80～1/3。即保留CDR区，而Ig分子中的C区不表达。小分子抗体类型有：①Fab片段抗体（VH+CH1）-(VL+CL)②Fv抗体VH+VL非共价结合

③单链抗体（SCFV）VH+VLLinker连接而成的单链重组蛋白特点：高亲和力，低分子量，穿透力强，免疫原性小，易与效应分子连接④单域抗体VHorVL表面疏水性强，与抗原非特异作用强⑤最小识别单位（MRU）单个CDR亲和力低，实际应用局限性大单链抗体的应用优点：①可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰