原位杂交技术

原位杂交实验要求及步骤原位杂交组织（或细胞）化学（InsituHybridizationHistochemistry,ISHH）简称原位杂交（InSituHybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。固定目的是：（1） 保持细胞结构；（2） 最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3） 使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2MHCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。

（2） 去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是TritonX-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。（3） 蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinaseK），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。杂交缓冲液孵育：杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。防止污染：由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180°C）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。双链DNA探针和靶DNA的变性：杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。如果用双链DNA探针进行杂交（包括检测RNA时），双链DNA探针在杂交前必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。杂交液：杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐类、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等。杂交液中含有较高浓度的Na+可使杂交率增加，可以减低探针与组织标本之间的静电结合。甲酰胺可使Tm降低，杂交液中含每1%的甲酰胺可分别使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的杂交温度降低0.35C，0.5C和0.65C。所以，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的（尤其对双链核酸探针）。在杂交液中加入牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。探针的浓度:

探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5~5.0pg/ml(0.5~5.0ng/p1)。最适宜的探针浓度要通过实验才能确定。探针的长度：一般应在50-300个碱基之间，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。二、试剂准备0.1MPBS(pH7.2):NaHPO-12HO61.6g、NaHPO-2HO5.6g、NaCl9g，TOC\o"1-5"\h\z. —、2,4 2 24 2加ddHO至2000ml，高压灭菌。20.2MPB((pH7.2)：NaHPO-12HO61.6g、NaHPO-2HO5.6g加ddHO2 4 2 2 4 2 2至1000ml，高压灭菌。0.1M甘氨酸：0.75g甘氨酸溶于0.1MPBS，定容至100ml，高压灭菌。4%多聚甲醛：多聚甲醛40g加ddHO400ml，加热至70°C左右，用1MNaOH一 一 、、一 2_. 一，倜pH至7.0，用ddHO定容至500ml，再加0.2MPBS500ml，总体积为10002ml。16XDenhardt溶液：聚乙烯毗咯酮0.4g、小牛血清白蛋白(BSA)0.4g、聚蔗糖0.4g，加ddHO至10ml，无菌抽滤、分装，-20C保存备用。2预杂交液：去离子甲酰胺10ml、50%硫酸葡聚糖4ml，于50C促溶后，再依次加入16XDenhardt液0.2ml、1MTris-HCl(pH8.0)0.2ml、5MNaCl1.2ml、0.5MEDTA(pH8.0)0.04ml、0.1M二硫苏糖醇2ml、ddHO2.21ml，2总体积为10ml。无菌抽滤、分装，-20C保存备用。临用前加入50mg/ml变性鲑鱼精DNA75pl/ml。20XSSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加水至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddHO定容至1000ml。2抗体稀释液：TritonX-10080pl、BSA0.2g，以0.05MPBS定容至20ml。TSM1：1MTris-HCl(pH8.0)10ml、5MNaCl2ml、1MMgCl1ml，加ddHO100ml。 22

TSM2（新鲜配制）：1MTris-HCl（pH9.5）10ml、5MNaCl2ml1MMgCl1r 一 2ml,加ddHO至100ml。,、 -2、. - ,、,、 、.-显色液（临用前现配）：5mlTSM2加显色液原液（NBT/BCIP）150pl,并加适量左旋咪唑使其终浓度为0.24pg/ml,避光。三、操作步骤（一） 取材、冰冻切片：将动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露心脏，刺破右心耳，将针尖刺入左心室用生理盐水灌注（灌注量约为动物体重的2倍），再注入等量的4%多聚甲醛。（见图2-7）。取材，置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1MPBS浸泡冲洗4-5次（换液：1次/hr）。将组织块入30%蔗糖/0.1MPBS液（4°C），1-2天后冰冻切片，将切片裱贴于原位杂交专用玻片上，切片厚度为15-20pm。（二） 探针制备与检测（定量）：随机引物制备cDNA核酸探针以DIGDNA标记检测试剂盒为例：（1） 探针制备：模板DNA（0.5-3pg）15pl，100C变性10min，冰浴5min。在冰浴中加：Hexanucleotidemix2pl，dNTPmix2pl，KlenowEnzyme1pl，反应总体积为20pl。37C孵育过夜。在上述20pl的标记产物中加4MLiCl2.5pl，75pl（无水乙醇预冷，轻轻混匀，-20C放置2hr。4C离心12000gX15min，弃上清。70%乙醇（预冷）50pl洗涤，7500gX5min，弃上清，晾干沉淀，加TE50pl溶解沉淀，-20C保存备用。（2） 探针敏感性检测：样品稀释：取dig-标记探针1pl用ddHO以1：10、1：100、1：1000、1：…、〜 21000、1：10000梯度稀释。取一张与点样器大小相近的尼龙膜，标记方向，ddHO中浸泡1min，6XSSC.、一… _-… - .一 2中浸泡10min，置点样器上，负压抽吸5min。将上述样品点于尼龙膜上，继续抽吸10min。取下尼龙膜，置紫外灯下10cm处照射5min，晾干。将膜置于适量预杂交液（5-10ml）中，37C预杂交10min。加入Anti-dig抗体（1：5000），37C杂交30min。洗膜：2XSSC/0.1%SDS室温洗10minX2次。

显色：15mlTSM2中加300pl显色液(NBT/BCIP),37°C避光显色30min。PCR法制备cDNA核酸探针：探针制备：以PCRDIGProbeSynthesisKit为例：在0.5ml离心管中，依次加入：PCR引物1(10pM)2pl；PCR引物1(10pM)2pl；质粒DNA模板(10-100pg)2pl；PCRDIGmix2pl(含dNTP和DIG-11-dUTP)；dNTPmix2pl；10XPCRbuffer5pl；Taq酶(2u/pl)1pl；加入适量ddH0使总体积达50pl。2将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93C预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93C45s一58C45s一72C60s，循环30-35次，最后在72C保温7min。在上述PCR产物中加入4MLiCl12.5pl、预冷无水乙醇375pl，轻轻混合后置于-20C2h，12000gX15min，弃上清。70%乙醇(预冷)120pl洗涤沉淀，离心7500gX5min，弃上清，晾干沉淀，加TE50pl溶解，-20C保存备用。探针检测：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DIG-DNA探针含量(采用目测法)。原位杂交反应(以DIG-cDNA探针为例)：0.1MPBS(pH7.2)浸5-10min。0.1M甘氨酸/0.1MPBS浸5min。0.3%TritonX-100/0.1MPBS浸10-15min。0.1MPBS洗5minX3次，加蛋白酶K(1pg/ml)，37C孵育30min。4%多聚甲醛浸5min。

0.1MPBS洗5minX2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。预杂交：滴加适量预杂交液，42°C30min。杂交：倾去预杂交液，在每张切片上滴加10-20pl杂交液(将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5ng/pl)，覆以盖玻片或蜡膜，42C过夜。洗片：4XSSC、2XSSC、1XSSC、0.5XSSC37C各洗20min；0.2XSSC37C洗10min；0.2XSSC与0.1MPBS各半洗10min；0.05MPBS洗5minX2次。3%BSA/0.05MPBS包被，37C3