动物细胞融合和单克隆抗体课件-高二下学期生物人教版选修3

1．阐明动物细胞融合的概念。2．说出植物体细胞杂交和动物细胞融合的区别。3．阐明单克隆抗体制备的基本流程。4．分析单克隆抗体制备过程中两次筛选所使用的方法和达到的目的。5．关注药物供给的“靶向”技术。学习目标1．概念：动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

融合后形成的具有两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。3．原理：细胞膜的流动性2．结果：与植物原生质体融合的方法相同物理方法：动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG）法生物方法：灭活病毒诱导法——动物细胞融合特有4．动物细胞融合的方法思考：19世纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片原理是什么？01原理

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。教材P52“生物技术资料卡”灭活：是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。

人细胞小鼠细胞细胞融合杂交细胞37℃40min红色荧光染料标记的膜蛋白绿色荧光染料标记的膜蛋白用荧光染料标记某种物质，利用其荧光特性，来反应研究对象的相关信息。荧光标记技术1970年弗雷和埃迪登(Frye和Edidin)人鼠细胞杂交实验：注意说明动物细胞融合与受精作用的区别（1）受精作用：是在同种生物之间进行的，精子与卵细胞的融合不需要任何诱导剂，受精卵内具备同种生物的两个亲本的遗传物质。（2）动物细胞融合可在不同物种间进行，由于物种间存在生殖隔离，所以自然条件下不能融合成杂交细胞，必须有诱导剂才能融合。形成的杂交细胞具备两个亲本细胞的遗传物质，从而体现两个亲本的遗传特性。4．诱导方式物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。（种间、属间、科间、动植物之间）5．意义：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体6．应用：动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞物理法：离心、振动、电激；化学法：聚乙二醇（PEG）物理法和化学法灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能新闻1：“血清/浆疗法”是否可以治疗新冠？国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中，增加了“恢复期血浆治疗”，并建议适用于病情进展较快、重型和危重型患者。“血清疗法”原理：当病原体入侵人体时，免疫系统会产生抗体，将抗体锁在敌人身上，将其标记为被破坏。恢复后，这些抗体会在人的血液中循环流通数月至数年。从理论上讲，将其中一些抗体转移给具有相同病毒的其他人可以帮助他们的身体抵抗它。或者，将这些抗体提供给健康的人，例如前线的医护人员，可能会为感染提供一些临时保护。新闻2：抗疫新招！玻利维亚开发驴血浆抗新冠血清玻利维亚《时代报》5月19日报道，玻利维亚国家卫生实验室正在三头驴身上进行实验，其产生的血清对新冠病毒的有效性估计“比人类血浆生成的血清至少高50倍”。动物血浆产生的血清与人类的不同，因为动物血清是经过多次“感染-免疫”过程产生的，而人类血浆产生的血清仅经过了一次免疫过程，所以动物产生的血清比人类的要“更浓缩”，抗病毒效果也会更强。提出问题：驴血浆抗体治疗方法有没有局限性呢？

自学教材P52－P53，回答下列问题：1．传统方法生产抗体的缺点？2．什么是单克隆抗体？3．课后查阅资料人体编码蛋白质的基因大约有25000个，那为什么体内产生的抗体能多达百万种以上？抗体的传统生产方法：从血清中分离抗体该法制备抗体的缺点：

产量低、纯度低，且抗体的特异性差。多种浆细胞动物体内多种抗体抗原1、为什么产量低？2、为什么纯度低？3、为什么特异性差？血清中有多种抗体因为血清中有多种抗体，会攻击多种抗原浆细胞数量有限（高度分化、分裂能力弱）读下面一段资料，找出单克隆抗体的概念人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的B细胞，形成细胞群。单克隆抗体的概念单克隆抗体：单个B细胞克隆形成的细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。提示1：对B细胞进行细胞培养可行吗？提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？问题：如何大量生产单克隆抗体？请尝试设计一个方案。提示3：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和骨髓瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？杂交瘤细胞单克隆抗体

既能产生特异性抗体，又能大量繁殖的细胞骨髓瘤细胞能无限增殖

+一个浆细胞只分泌一种特异性抗体设计方案?米尔斯坦科勒BB、B瘤、瘤瘤（B、瘤）（一选）选择性培养基：只有杂交瘤细胞才能存活获得产生相应抗体的B细胞（二选）：选能产生所需专一抗体的杂交瘤细胞√体外培养小鼠腹腔内培养杂交瘤细胞特点：既能产生特异性抗体，又能大量增殖。如何筛选出培养液中的杂交瘤细胞？①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞S途径D途径D途径S途径D途径合成DNA合成DNA合成DNA不能无限增殖能无限增殖能无限增殖经过选择性培养基筛选的杂交瘤细胞群进行克隆是否就得到产生纯度高的抗体？还需怎么办？1．单克隆抗体的制备问题思考1．单克隆抗体的制备

※知识拓展：如何进行杂交瘤细胞的克隆化培养及抗体检测？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。阳性孔多孔板专一抗体阳性检验有限稀释法通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的。（1）取出阳性孔培养液将其稀释到每毫升10个细胞。（2）如果在多孔板中每孔加0．1毫升，使每孔内落入一个细胞。（3）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。项目第一次筛选第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因方法筛选结果诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等用特定的选择性培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。筛选出融合的杂种细胞选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞项目腹腔培养体外培养优点缺点易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低规模小，产量少可大规模培养，大量生产需要人为控制培养条件，成本相对较高相关技术和原理：动物细胞融合、动物细胞培养；细胞膜的流动性、细胞增殖2．单克隆抗体的应用单克隆抗体最主要的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。由于单克隆抗体纯度高、特异性强，所以能准确地识别各种______物质的细微差异，并跟一定抗原发生_____________，因此，单克隆抗体在诊断的应用上，具有准确、高效、简易、快速的优点。作为诊断试剂抗原特异性结合抗（人绒毛膜促性腺激素）单克隆抗体

在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。

正常的性成熟女性每个月都会排卵，最佳受精时间为排卵后24-36小时。在女性的月经周期中，尿液中的促黄体生成素（SH）会在排卵前24小时左右出现高峰值。据此可推测，排卵试纸起核心作用的物质是_____________________________。抗促黄体生成素单克隆抗体2．单克隆抗体的应用作为诊断试剂用于治疗疾病和运载药物2．单克隆抗体的应用优点：位置准确、疗效高、副作用小如果把抗癌细胞的单克隆抗体跟放射性同位素、化学药物或细胞毒素相结合，制成“____________”，注入体内，借助单克隆抗体的______作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。生物导弹导向2．单克隆抗体的应用2．单克隆抗体的应用2017年全球销售额前五的单抗药物商品名中文名称公司适应症2017年销售额(亿美元）Humria阿达木单抗Abbbie自身免疫性疾病184．21rituxan利妥昔单抗Roche白血病等73．88Herceptin曲妥珠单抗Roche乳腺癌等多种癌症70．14Avastin贝伐珠单抗Roche结肠癌等多种癌症66．88Remicade英夫利昔单抗J&J/MSD自身免疫性疾病63．152018诺贝尔生理学或医学奖公布：让治愈癌症成为现实美国免疫学家詹姆斯·艾利森（JamesPAlison）日本免疫学家本庶佑（TasukuHonjo）Tc细胞PD-1PD-L1Tc细胞PD-1PD-L1癌细胞癌细胞细胞膜具有流动性物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒形成杂交细胞突破了远缘杂交不亲和的障碍制备单克隆抗体单克隆抗体杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞群分泌特异抗体的杂交瘤细胞筛选二体外或体内培养筛选一

诱导融合提取动物细胞融合技术动物细胞培养技术单克隆抗体的制备既能大量繁殖又能产生专一抗体特异性强灵敏度高可大量制备骨髓瘤细胞已免疫的B淋巴细胞注射抗原请用箭头把以下代表单克隆抗体制备过程步骤的图解的字母按正确顺序连接起来。

1．关于动物细胞融合与植物体细胞杂交技术的比较，下列叙述合理的是(

)A．均可使用PEG、电激或灭活病毒诱导细胞融合B．两者都可以跨越种属间的生殖隔离C．两者都可以体现细胞的全能性D．在适宜条件下，均可发育成完整个体B2．科学家以乙肝病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A．利用该单克隆抗体可以诊断是否感染乙肝病毒B．体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对乙肝病毒的单克隆抗体C．将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D．将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A3．20世纪30年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞，这些多核细胞可能的来源是（）A．体细胞在有丝分裂过程中，染色体完成了复制，纺锤体的形成受到损坏，导致细胞不能分裂成两个子细胞而形成多核细胞B．体细胞在有丝分裂过程中，体内的有关病毒阻碍了细胞的分裂过程，导致细胞不能一次形成两个子细胞而形成多核细胞C．患者的体细胞在病毒诱导下，由两个或多个细胞核直接融合形成了多核细胞D．患者体内的病毒直接诱导多个体细胞的细胞融合而形成多核细胞D4．(2019江苏改编)如图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT－)，在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述错误的是A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础√D、SDDD、SD、S5．Graves病(GD)可导致甲状腺功能亢进。研究发现，GD患者甲状腺细胞表面表达大量细胞间黏附分子1(ICAM－1)，导致甲状腺肿大。科研人员通过制备单克隆抗体，对治疗GD进行了尝试。(1)用ICAM－1作为抗原间隔多次免疫若干只小鼠，几周后取这些免疫小鼠的血清，分别加入多孔培养板的不同孔中，多孔培养板中需加入____________以检测这些小鼠产生的抗体。依据反应结果，选出抗原—抗体反应最____________(填“强”或“弱”)的培养孔所对应的小鼠M。ICAM－1强(2)取小鼠M的脾脏细胞制成细胞悬液，与实验用骨髓瘤细胞进行融合，用选择培养基筛选得到具有______________能力的细胞。核酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径(如图)。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。可用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”筛选出特定的杂交瘤细胞。无限增殖DS融合前将部分培养细胞置于含HAT的选择培养基中培养，一段时间后培养基中____________(填“有”或“无”)骨髓瘤细胞生长，说明培养基符合实验要求。杂交瘤细胞可以在HAT培养基上大量增殖的原因是__________________________________。(3)将获得的上述细胞在多孔培养板上培养，用ICAM－1检测，从中选择_____________的杂交瘤细胞，将其植入小鼠腹腔中进行克隆培养，一段时间后从小鼠腹水中提取实验用抗体。无杂交瘤细胞可以进行补救合成途径大量产生抗ICAM－1抗体D途径S途径6．（2014新课标Ⅰ卷）某研究者用抗原（A）分别免疫3只同种小鼠（X、Y和Z），每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价（能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数），结果如图所示。若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞（染色体数目为40条），并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（染色体数目为60条）按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题：①制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16000以上，则小鼠最少需要经过_______次免疫后才能有符合要求的。达到要求的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是__________小鼠，理由是__________________________。4YY小鼠的血清抗体效价最高②细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有_______________________________________________________________，体系中出现多种类型细胞的原因是_____________________________________。③杂交瘤细胞中有_____个细胞核，染色体数目最多是_______条。④未融合的B淋巴细胞经过多次传代培养后都不能存活，原因是___________________。B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融且融合率达不到100%合形成的细胞细胞融合是随机的，1100不能无限增殖7．(2020全国Ⅰ卷)为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。回答下列问题：(1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是_____________________________________________________。诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞《一轮复习讲义》P365(3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于____________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_______________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是___________________________。(2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：___________________________________________________________________________________________。

取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液选择培养基只有杂交瘤细胞能够生存抗原与抗体的反应具有特异性8．“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，由单克隆抗体与药物结合而成，单克隆抗体的制备过程如图所示。(1)若只考虑细胞两两融合，B过程会获得

种类型的细胞。经特定选择培养基筛选后，

和融合的

的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。

3具有同种核未融合的亲本细胞(2)图示过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体，理由是

。

(3)“生物导弹”中单克隆抗体的作用是

。

(4)除“生物导弹”外，请说出单克隆抗体在临床上的其他应用(答出两点)。

小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在着排异反应将药物定向运到靶细胞作为诊断试剂；单克隆抗体自身也能用于治疗疾病。通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。抗体的人源化改造多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体蛋白质工程生产抗体CHO细胞科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出无限增殖调控基因（prG），可将prG基因导入能产生抗体的浆细胞中，导入prG基因的浆细胞具有的特点是