DB37-T 3893-2020 芋头病毒检测技术规程-（高清版）

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DB37山 东 省 地 方 标 准DB37/T3893—2020芋头病毒检测技术规程20202020033120200501山东省市场监督管理局发布前 言本标准由山东省农业农村厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。芋头病毒检测技术规程范围（Dasheenmosaic（Cucumbermosaicvirus，CMV）的RT-PCR本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法中文名：芋花叶病毒中文名：芋花叶病毒学名：Dasheenmosaicvirus缩写：DsMV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）750nmDsMV3.2黄瓜花叶病毒。中文名：黄瓜花叶病毒学名：Cucumbermosaicvirus缩写：CMV分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径28nm～30nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。4主要仪器设备、用具和试剂仪器设备和用具主要有：PCRh)普通冰箱（0℃～4℃）；（10、100、200、1000、5000μL）；RNase-free吸头（10、200、1000μL）；RNase-free（1.5、2.0RNase-freePCR试剂所有实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录A；除特殊说明外，均为符合GB/T6682，实验用水为无菌超纯水或去离子水。RNA多糖多酚植物RNAc)异丙醇；d)75%c)异丙醇；d)75%乙醇；e)RNase-free超纯水。RNaseAMVdNTPs（10mM）；PCRDNATaqMasterMixDNA100bp～2000Gelred（10000×）10-4Gelred1%RT-PCR芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒，利用TransZolPlant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。（2℃～-70℃DsMV或CMVRNA100mg2ml1mL（1mL/100mg样品），剧烈振荡混匀，室温放置5min；4℃，13000rpm离心5min。1.5mL21/42min～3。4℃，13000rpm10。1.5mL104℃，13000rpm101mL754℃，13000rpm5。5.3.6RNase-freeH25.3.6RNase-freeH2ORNA-80℃备用。5.4引物合成依据文献报道引物序列进行合成（DsMV：Reyesetal.，2009；CMV：姚明华等，2009）。引物配制成10μmol/L储存液备用。表1RT-PCR检测cDNA取纯化的RNA合成cDNA第一链，反应体系为25μL，各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，反应体系成分见表2。将上述试剂依次加入RNase-free离心管中，混匀后，放置于42℃恒温水浴中1h后，转入72℃恒温水浴5min，用于RT-PCR扩增或置-20℃以下冰箱备用。检测病毒引物序列扩增片段大小/bpDsMV正义引物：5’-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3’反义引物：5’-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-3’1034CMV7775.5.2.2反应程序将上述反应成分混合好后，放置PCR仪进行反应，反应程序参数见表4。表4反应程序参数5.5.35.5.2.2反应程序将上述反应成分混合好后，放置PCR仪进行反应，反应程序参数见表4。表4反应程序参数5.5.3PCR将1%PCR10μL，加入上样缓冲液（终浓度为1×），混匀后移入胶孔，并在样品孔一侧加入DNA3V/cm～5V/cm2/3泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，拍摄并记录。成分用量RNA1.0μgdNTP（10mMeach）5.0μL随机引物（10μmol/L）2.0μL5×ReverseTranscriptaseBuffer5.0μLRNase抑制剂1.0μLAMV逆转录酶（10U）1.0μLRNase-freeH2O补足25.0μLPCR取合成的cDNA第一链进行RT-PCR反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以水代替模板作为空白对照。反应体系成分见表3。表3反应体系成分表成分用量2×EsTaqMasterMix25.0μL正义引物（10μmol/L）2.0μL反义引物（10μmol/L）2.0μLcDNA2.0μLRNase-freeH2O补足50.0μL步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃/