电针手厥阴心包经穴对 MCAO 大鼠血清、脑组织中 NGF 和 Nogo

电针手厥阴心包经穴对MCAO大鼠血清、脑组织中NGF和Nogo〔〕:

摘要：目的讨论电针心经穴对脑缺血损伤的干预效应及神经保护、血管新生的作用。方法将SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心经组、肺经组，每组10只。采用颈外动脉插入线栓法复制局灶性脑缺血模型。心经组取"灵道";"极泉";"少海";"神门";穴，肺经组取"天府";"尺泽";"列缺";"太渊";穴，于造模后6、24、48、72h进展电针治疗，每次30min。用TTC染色法检测脑梗死体积，用酶联免疫吸附法检测血清中神经生长抑制因子〔Nogo-A〕的含量，免疫组化法检测脑梗死区Nogo-A的表达程度。结果与正常组、假手术比拟，模型组血清Nogo-A含量增多〔P0.05〕。结论电针可降低血清、脑组织中Nogo-A的含量，且心经组作用优于肺经组，对脑缺血后神经修复具有一定促进作用。

关键词：MCAO大鼠；电针；心经穴

本文引用格式：马纹蕊,武娟,洒玉萍,等.电针手厥阴心包经穴对MCAO大鼠血清、脑组织中NGF和Nogo-A的影响[J].世界最新医学信息文摘,2022,19(80):221-223.

0引言

脑梗死是由于动脉狭窄或完全闭塞，导致脑组织缺氧、缺血、坏死，从而引起的一种脑血管疾病。根据临床报告显示，目前脑缺血疾病的治疗普遍应用针灸，研究发现针灸可以干预脑缺导致血发病相关的多种危险因素[1-2]，对患者语言、运动、神志等功能的进步和预防并改善并发症都有显著的促进作用[3-5]。大量文献记载[6-7]电针"内关";和"神门";对脑缺血损伤后心脑组织细胞凋亡与炎性损伤有抵抗作用，电针"内关";、"曲泽";有促进脑缺血血管新生的作用。此次实验拟以大鼠局灶性脑缺血模型〔MCAO〕为观察对象，观察电针心经穴对大鼠神经功能缺损、脑梗死体积、微血管密度以及对大鼠血清和脑组织中Nogo-A表达的影响。探究电针心经穴对脑缺血损伤的干预效应及神经保护、血管新生的作用，为心经穴治疗脑血管病及从心治脑的研究提供实验根据。

1材料与方法

1.1动物与分组

SPF级安康成年雄性SD大鼠50只，体重220~250g。其饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按照SPF级实验动物的要求进展制备和消毒，造模前禁食1d。

动物分组采用先造模后分组的方式，将大鼠随机分为5组，每组6只。正常组：不作处理；模型组：MCAO模型对照组；假手术组：大鼠切开颈部皮肤，别离CCA及ICA至PPA，不插栓线；手少阴心经穴组：造模＋电针心经穴；手太阴肺经穴组：造模＋电针肺经穴。

1.2主要试剂与仪器

主要试剂：Nogo-A酶联免疫(ELISA)试剂盒；Nogo-A兔抗鼠抗体；SABC免疫组化染色试剂盒；

主要仪器：SDZ-II华佗电针治疗仪、华佗牌0.30mmx15mm毫针；全自动酶标洗板机；酶标仪；电热恒温枯燥箱；石蜡切片机;双目显微镜；显微摄像系统；高明晰度彩色病理图文分析系统。

1.3造模方法

采用大鼠大脑中动脉持久性局灶性缺血模型。参照ZeaLonga和Koizumi[8-9]报道的方法，即用颈外动脉插入线栓法建立MCAO脑缺血模型。造模完成后对各组大鼠采用ZeaLonga5级4分制评分：无神经功能缺损计0分；梗死对侧前爪内收、伸直障碍计1分；向偏瘫侧转圈者计2分；行走时向偏瘫侧倾倒计3分；意识丧失、不能行走计4分。选取评分为1-3分的大鼠纳入观察。假手术组仅暴露颈部正中切口，不做其他处理。

1.4针刺方法

根据?实验针灸学?[10]动物穴位图谱及拟人比照法定位：按照经脉"从胸走手";的循行方向，依次选取瘫痪侧肢体不同节段的常用穴位，作为心经、肺经的代表穴。手少阴心经选取神门、灵道、少海、极泉；手太阴肺经选取太渊、列缺、尺泽、天府。

于造模后6、24、48、72h时进展治疗，针刺瘫痪侧上肢，以15mm、36号毫针刺入穴位，针刺深度3-4mm，接SDZ-Ⅱ型电针治疗仪。"神门";"灵道";一组，"少海";"极泉";一组，"太渊";"列缺";一组，"尺泽";"天府";一组，正极接近心端穴位，负极接远心端穴位，采用连续波，频率为20Hz，输出电压2-4V，输出电流4-6mA以部分组织轻颤为度，时间30min。

1.5观察指标及检测方法

大鼠血清Nogo-A含量的检测：治疗完毕后，所有大鼠用10%水合氯醛〔0.3mL/100g〕腹腔注射麻醉，腹主动脉插管取血4-5mL，静置30min后离心(3000r/min,15min)，用移液枪抽取上清液，严格按照试剂盒的操作说明，应用ELISA法检测血清Nogo-A的浓度。以标准物的浓度为横坐标，吸光度(OD)值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

Nogo-A在脑梗死区的阳性表达：处死大鼠，断头取脑，切取病灶侧脑组织，4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、透蜡、包埋、切片，切片厚度4um，选取相邻的切片分别应用免疫组织化学法检测梗死区脑组织的Nogo-A表达量。详细步骤：石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min，采用高压修复，当高压锅渐渐喷气时，计时2min，自然冷却，蒸馏水水洗，PBS洗5minx3次，3%H2O2室温20min，PBS洗2minx3次，滴加一抗兔抗鼠〔1:100〕，4℃过夜，PBS洗2minx3次，滴加二步法二抗通用工作液，室温30min，PBS洗3minx3次，DAB显色，苏木精复染，脱水透明，分片。免疫组化后，Nogo-A在脑细胞胞质及突起内标记为棕黄色的颗粒。应用高明晰度彩色病理图文分析系统，每只大鼠取5张切片，每张切片选取患侧脑组织海马区C1、C2、C3周边选择3个高倍〔x400〕视野进展NGF和Nogo-A阳性表达吸光度值测定。

1.6统计学方法

计量资料采用均数加减标准差〔s〕表示。所有资料进展正态性检验。符合正态分布者，多组计量资料采用单因素方差分析，方差齐者用LSD法和SNK法，方差不齐者用Tambane"sT2或Dunnett"sT3法。不符合正态分布者，采用多个独立样本比拟的秩和检验。所有数据均采用SPSS17.0统计软件进展分析，结果以P0.05〕,说明模型成功复制，治疗前组间具有可比性；〔3〕组内比拟：与2h比，心经组在24h、48h、72h神经功能缺损评清楚显降低，差异有统计学意义，心经组神经功能缺损评清楚显降低，差异具有统计学意义〔P0.05〕;〔4〕组间比拟：与模型组各时相点比，心经组在48h、72h神经功能缺损评分有不同程度的下降〔P0.05〕；与肺经组各时相点比，心经组评分无统计学差异。提示电针心经穴组可较好的改善大鼠神经功能缺损的病症，肺经穴组未见明显的改善。

2.2各组大鼠脑梗死体积的比拟

由表2可知，〔1〕各组大鼠全脑体积比拟无差异〔P>0.05〕，但模型组、肺经穴组数值上相对偏大，可能与脑缺血后脑组织水胖有关系；〔2〕正常组、假手术组大鼠无脑梗死杜，说明手术本身不会引起脑缺血改变；〔3〕与正常组和假手术组比拟，模型组、心经肺经穴组脑梗死体积、梗死率明显增大〔P0.05〕，提示三组作用相当，电针干预调节暂未能表达出经脉的特异性。

2.3各组大鼠血清中Nogo-A表达的比拟

由图一可知：空白组和假手术组Nogo-A的表达随时间推移无明显变化,模型组和假手术组组Nogo-A的表达开始升高至到达顶峰,然后明显下降,但仍稍高于空白组。电针组各时间点Nogo-A的表达均低于模型组和假手术组,后两组Nogo-A表达程度无明显差异。

2.4各组大鼠脑梗死区中Nogo-A表达的比拟

由图1可知：与正常组、假手术组比，模型组脑梗死区NGF阳性表达量均升高〔P0.05〕，说明假手术过程、造模过程及电针干预对脑梗死区Nogo-A的表达无明显调节作用，可能与样本量小或〔和〕Nogo-A在脑缺血急性期脑组织中的变化趋势不稳定有关。

3讨论

脑缺血后患者的康复主要取决于中枢神经系统修复，基于脑血管新生为构造根底的前提下[11-12]，多种神经功能因子之间的互相作用决定神经功能修复的好与坏。多种神经功能因子中NGF作为一种重要因子调节神经细胞生长，对神经元的生长、发育、分化及再生和功能性表达都具有重要的调控作用；其次Nogo-A作为Nogo蛋白家族中一种，在CNS损伤后抑制轴突再生的才能最为强烈[13]。

大量文献研究显示[14-18]，针刺"内关";"足三里";"水沟";"百会";等穴，均可有效的增加内源性神经生长因子的表达，从而改善大鼠脑缺血后突触超微构造，促进神经修复，改善肢体功能，到达抗脑缺血损伤的作用。同时研究[19-20]还显示：电针治疗可下调脑堵塞区神经生长抑制因子Nogo-A的表达，诱导神经轴突再生，减轻脑梗死后的神经损害。

?内经?中记载心主血脉，心主血脉是人体神志活动的物质根底，如?素问痿论?："心主身之血脉";，?素问六节?："诸血者皆属于心";，故二者的关系是功能活动和物质根底的关系。

根据中医理论，心具有主血脉的生理功能，而血液对人体四肢百骸、诸官弯均有霜养作用，脑亦需要血液的满养。中医学藏象学说，将脑的生理和病理统归于心而分属于五脏，认为心是"五脏六腑之大主[19]";，人体脏腑器官的功能活动，气血津液的运行，以及脏腑之间的联络和协调，均须通过经络系统的运输传导、联络调节得以实现，并使之成为一个有机的整体[20]。心与脑的经络联络有：手少阴心经经目系入脑，其经别也与手太阳小肠经会于目内眦而入脑；心包络为心之包膜，与心密不可分，而手厥阴心包经络于上、中、下三焦，人之头部〔包括脑〕又归属上焦，这样，又加强了心与脑的联络；?素问骨空论?云：督脉者，入络脑上贯心";，通过督脉，加强了心与脑的联络；心与小肠相表里，而手太阳小肠经的经筋从目周入脑，这样，脑与心又多一条联络途径。以上为脑与心的直接联络。因此在心脑病症的治疗方面，临床或从心而治，或从脑而治，或心脑同冶，均能获得良好的疗效。可见，心与脑的关系是非常亲密的。说明"心脑共主神明";实际上是以心主血脉为物质根底，联络心脑与络脉-血管系统理念相一致的整体观。

心经作为心所属经脉，与心有着亲密的联络。手少阴心经起于心中，联络心系、肺、咽及目系，属心络小肠，浅出腋下，循行于上肢内侧后缘，止于小指桡侧端。其络脉在腕关节后一寸处分出上行，沿本经进入心中，向上联络舌相部，归属于眼与脑相连的系带。其经别分出后进入腋下两筋之间，归属于心脏，向上走到喉呢，成出面部，与手太阳小肠经会于目内眦。其经筋起于手小指内侧，结于碗豆骨处，向上结于肘内，交手太阴经筋伏行于孔头里，结于胸中，沿脑向下，联络于脐部。

〔1〕在生理上：手少阴心经加强了心与人体体表、官窍及其他脏腑之间的联络，如?灵枢海论?曰："夫十二经脉者，内属于腑脏，外络于肢节";。

〔2〕从病理上：手少阴心经为病，就会表现为：咽喉枯燥，心口痛，口渴；前臂麻木酸痛等，如?灵枢经脉?曰："益干，心痛，渴而欲饮，是为臂厥";。?灵枢本神?："心藏脉，脉舍神，心气虚那么悲，实那么笑不休";。?灵枢五邪?："邪在心，那么病心痛，喜悲，时眩仆";。

〔3〕治疗上：手少阴心经可以治疗与心相关疾病，如?素问刺热?："心热病者，先不乐，数日乃热。热争那么卒心痛，烦闷善喉，头痛、面赤无汗刺手少阴、太阳";，宋王惟一?新铸铜人腧穴针灸图经?曰："灵道治心痛悲恐";。

心经与脑关系也很亲密。其经络经目系入脑，其经别也与手太阳小肠经会于目内眦而入脑。正是基于此理论，历代医家在治疗与脑相关疾病时，都会用到手少阴心经的相关经穴。如王惟一?新铸铜人腧穴针灸图经?曰："少海治寒热齿麟痛，目瞭发狂";。皇甫谨?针灸曱乙经卷七?曰："风陵头痛，少海主之";。杨继洲?针灸大成?："神门去心性之呆疾";。徐凤?针灸大全?："心中惊悸，言语错乱，取少海二穴，少府二穴，心命二穴";，心性呆疾，悲泣不已，取通里二穴，后溪二穴，神门二穴，大钟二穴";。近代医家根据以上理论，取手少阴心经的相关经穴治疗与脑相关疾病如失眠、郁证、中风、癲痫、痴呆、脑萎、神经衰弱等疾病，都有非常确切地疗效。

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