病毒抗原与抗体检测技术

关于病毒抗原与抗体检测技术第1页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、抗原—抗体反应特异性高可逆氢键、范德华力、静电吸引力可见抗原-抗体比例适宜，复合物相成团第2页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、影响反应的因素电解质pH≥7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀温度37℃温度升高，反应加快<56℃酸碱度pH6~8接近等电点时易出现假阳性第3页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第一节免疫荧光技术ImmunofluorescenceassayIFA能解决：是什么在哪里有多少荧光激发光谱发射光谱荧光效率荧光寿命荧光猝灭荧光偏振第4页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第一节免疫荧光技术荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定第5页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验（一）原理用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分子探针，检查细胞或组织内相应的病毒抗体或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光，用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、定量。第6页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验（二）类型荧光抗体法荧光抗原法免疫细胞（组织）化学技术第7页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验（三）方法制备标本制备荧光抗体荧光抗体染色荧光显微镜检查第8页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本培养敏感细胞（细胞爬片）↓种毒

↓固定、干燥丙酮第9页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本临床样本（非固型组织）↓涂片↓固定、干燥第10页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验1.制作病毒染色标本尸检样品（3~5mm）

↓↓↓脱水脱色冰冻切片印片↓↓石蜡固定、脱蜡丙酮固定、干燥第11页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备制备抗体用高纯度病毒免疫动物获取血清，分离IgG，提纯

家兔、绵羊、山羊高特异性高亲和力第12页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验2.荧光抗体制备标记荧光素共价键结合抗体+荧光素↓4℃持续搅拌数小时纯化（离心、透析、过滤）第13页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体以FITC为例荧光（F）蛋白（P）结合率调整制备液至A280mm=12.87×A495mm

A280mm-0.35×A495mm比值越大，抗体结合荧光素越多F/P=第14页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验3.鉴定制成的荧光抗体测定抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体特异性染色滴度：倍比稀释第15页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色直接法第16页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色间接法第17页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验4.荧光抗体染色补体法荧光标记抗补体抗体双标记法两种荧光素抗体检测两种抗原第18页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、免疫荧光试验5.设立对照区分特异性和非特异性染色标本自发荧光对照荧光抗体对照阳性抗原对照阻断试验第19页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、免疫荧光显微镜技术荧光显微镜利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

第20页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、免疫荧光显微镜技术光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片光路：透射光、落射光聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器镜头：消色差镜头第21页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、免疫荧光显微镜技术透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。第22页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五四、时间分辩免疫荧光技术Time-resolvedfluoroimmunoassayTR-FIA（一）原理自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光铕Ed3+锝Tb3+钐Sm3+镝Dy3+第23页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型双抗体夹心法固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。第24页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五四、时间分辩免疫荧光技术（二）方法类型固相抗体竞争法待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。固相抗原竞争法待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。第25页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第二节酶免疫技术Enzymeimmunoassay抗原抗体反应特异性酶高效催化反应专一性

第26页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第二节酶免疫技术酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶HRP

邻苯二胺OPD

四甲替联苯胺TMB

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色

黄色

棕色

兰色蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶AP4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色

400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420第27页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第二节酶免疫技术酶标记戊二醛交联法过碘酸氧化法醛基酶蛋白质HRP过碘酸盐HRP醛基第28页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第二节酶免疫技术固相载体塑料制品微粒膜载体NC膜、尼龙膜第29页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第二节酶免疫技术包被与封闭包被适宜浓度蛋白质封闭二次包被填补空隙小牛血清第30页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、酶联免疫吸附试验Enzyme-linkedimmunosorbentassayELISA酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）发生特异性反应，加入酶底物，通过酶对底物的显色反应，对待测抗原（抗体）进行定位、定性或定量分析。第31页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第32页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五间接法检测抗体+++固相抗原标本酶标抗体底物显色第33页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五双抗体夹心法检测抗原+++固相抗体标本酶标抗体底物显色第34页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五竞争法可检测抗原、抗体YYY+YYY+YYY参考管酶标抗原YYY+YYY+YYY待测管酶标抗原抗原第35页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五捕获法检测IgM抗体+++抗IgM标本抗原酶标抗体显色

（含IgM）+第36页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、免疫酶染色试验ImmunoenzymaticstainingtestIEST酶标抗体（抗原）—抗原（抗体）复合物

底物

有色底物第37页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、免疫酶染色试验细胞免疫酶染色均相酶免疫测定——无需分离游离与结合的酶标记物酶标记物结合后改变酶活性非均相酶免疫测定—需分离游离与结合的酶标记物液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记物固相：ELISA第38页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第三节放射免疫技术RadioimmunoassayRIA利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应特异性相结合进行定量分析放射免疫核素标记抗原与未标记抗原竞争性结合特异性抗体免疫放射核素标记抗体结合待测抗原R.S.Yalow第39页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第三节放射免疫技术125I、131I、3H、14C标记纯化鉴定放射性免疫活性第40页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第三节放射免疫技术第41页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第三节放射免疫技术放射免疫竞争法第42页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五++++++++BoundFreeAgAb6/8=0.754/8=0.52/8=0.251/8=0.125B/B+F第43页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第三节放射免疫技术放射免疫以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(B＋F)与Ag的量变存在着函数关系－剂量反应曲线第44页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五第四节血清学试验中和试验血凝/血凝抑制试验补体结合试验第45页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验neutralizationtest体外将病毒与特异性抗体混合并发生反应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的方法。

中和抗体第46页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验（一）原理中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细胞，使病毒失去感染力。当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细胞再观察敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。第47页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验（二）方法步骤病毒---已知滴度，并有感染力测滴度：细胞培养，将病毒10倍稀释接种敏感细胞或动物，观察CPE或动物感染情况，确定滴定终点以CCID50或LD50表示标准病毒试验浓度：100CCID50/单位体积或100LD50/单位体积第48页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验抗体用细胞培养法测病毒抗体的滴度：将倍比稀释的病毒抗血清液与等量的标准病毒液混合，接种敏感细胞，观察CPE。病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细胞免受病毒感染的最高稀释倍数的倒数。抗体滴度的含义：抑制CPE的最高稀释倍数的抗血清中，每单位体积含一个抗体单位。第49页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验举例如观察结果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是当抗血清稀释到320倍时，0.1ml抗血清含有1个抗体单位。请问：1：160及1：40含有几个抗体单位？标准抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml第50页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验宿主细胞培养:观察CPE和空斑（最理想和常用）鸡胚：观察鸡胚的死亡（流感）、绒毛尿囊腔上痘疮及血凝现象（天花、牛痘、HSV）动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙脑病毒、森林脑炎病毒第51页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验（二）方法步骤固定血清—稀释抗病毒法检测病毒及其滴度固定病毒—稀释抗血清法检测血清效价第52页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验（二）方法步骤固定血清—稀释病毒法用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清(20个抗体单位/单位体积)混合、孵育，使二者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。第53页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定血清稀释病毒法试验材料宿主:敏感细胞和动物、鸡胚标准抗病毒血清(20个抗体单位/0.1ml)病毒分离物试验步骤不同浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细胞培养液倍比稀释病毒不同浓度病毒液与等量阴性血清混合接种细胞,设正常细胞对照，CO2孵箱观察CPE中和试验病毒CCID50：当抗血清组的CCID50与阴性组之差的对数大于2,才说明中和试验阳性。第54页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定血清稀释病毒法阴性血清病毒CCID50的计算病毒稀释度CPE孔数/接种孔数

累计数CPE数存活数CPE阳性比例CPE阳性率（％）10-45/510010/10100.010-54/5515/683.010-61/5151/617.010-70/50100/10

0第55页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定血清稀释病毒法距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝（83－50）/（83－17）＝0.5lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-5+0.5×lg0.1=-5.5,其反对数是10-5.5.阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5/0.1ml。第56页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定血清稀释病毒法阳性血清病毒CCID50的计算病毒稀释度CPE孔数/接种孔数累计数CPE数存活数CPE阳性比例CPE阳性率（％）10-25/510010/10100.010-33/5525/771.010-42/5252/729.010-50/50100/10

0第57页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定血清稀释病毒法距离比例＝（大于50%的CPE阳性率—50%）/（大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝（71－50）/（71－29）＝0.5大于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-3+0.5×lg0.1=-3.5,其反对数是10-3.5。阳性血清组的病毒CCID50为10-3.5/0.1ml。因抗血清组的CCID50为10-3.5，阴性血清组的病毒CCID50为10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分离的病毒是与中和抗体相对应的病毒。第58页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五一、中和试验（二）方法步骤固定病毒—稀释血清法用于血清抗体滴度的测量。用已知病毒检测位置抗体滴度。100CCID50/单位体积的病毒+连续倍比稀释血清→孵育1h→接种敏感宿主→观察不同稀释度的血清保护宿主感染病毒的情况第59页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定病毒稀释血清法试验材料:敏感宿主标准滴定的病毒100CCID50/0.1ml急性期或恢复期血清试验步骤细胞培养液倍比稀释急性或恢复期血清取不同稀释浓度血清与标准病毒混合并37℃孵育1h取混合液0.2ml接种细胞,CO2孵箱观察CPE50％血清中和终点：50%细胞不产生细胞病变的血清稀释度第60页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定病毒稀释血清法恢复期血清中和病毒的结果血清稀释度CPE孔数/接种孔数累计数CPE数无CPE数CPE阳性比例CPE阳性率（％）1：16(10-1.2)0/4080/80.01：32(10-1.5)1/4141/520.01：64(10-1.8)3/4414/580.01：128(10-2.1)4/4808/8100.0第61页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五固定病毒稀释血清法距离比例＝（50%—小于50%的CPE阳性率）/（大于50%的CPE阳性率－小于50%的CPE阳性率）＝（50－20）/（80－20）＝0.550%血清中和终点的范围:1:32与1:64之间。中和终点浓度=小于50%的CPE阳性率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数=lg10-1.5+0.5×lg0.5=-1.65,其反对数是1/45即50%血清中和终点为1:45含义：1:45稀释度的恢复期血清可保护50%细胞不产生细胞病变效应。第62页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五二、血凝/血抑血凝HA第63页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五血凝抑制HI第64页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五

123456789101112血凝试验HA试验方法选择96孔板（V型）病毒液倍比稀释稀释好后加鸡红细胞混匀后±20℃室温静置30min+50μlPBS吸出一半1:21:221:231:24+100μl病毒液+50μl鸡红细胞吸弃一半第65页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五血凝试验HA血凝滴度：以出现++的稀释度的倒数为判定终点,为1个血凝单位。凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，即0.5ml病毒液含1个血凝单位。第66页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验补体：正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，辅助抗体介导免疫溶菌和溶血作用。对热不稳定。绵羊红细胞与抗绵羊红细胞抗体（溶血素）作用形成溶血素致敏的绵羊红细胞。补体可使这种致敏红细胞溶解。补体可结合任何病毒抗原抗体复合物第67页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。第68页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验有3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即SRBC与相应溶血素，形成致敏红细胞。第69页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验病毒抗原从组织培养、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应

第70页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验抗体免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动物，以免发生交叉反应血清样品应加热灭活处理，消除补体活性和非特异性抗补体活性人和豚鼠灭活温度为56℃；家兔和马灭活温度为65℃第71页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验补体检测人和哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体临用前使用1％SRBC制备绵羊颈静脉采血，生理盐水洗涤溶血素用绵羊红细胞免疫家兔获得效价达到1:4000可获得56℃30分钟灭活，加甘油后长期保存稀释液含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定第72页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验溶血素的滴定先将溶血素稀释成1:100~1:1000,再依次加入溶血素0.1ml，钙镁盐水0.2ml，1:60补体0.2ml、1％绵羊红细胞0.1ml，混匀后再水浴结果判定：完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细胞;不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色透明溶血素效价的测定;以完全溶血的最高稀释倍数确定为1个单位本例1个单位的溶血素的效价为1：4000；正式使用2个单位第73页，共79页，2022年，5月20日，12点42分，星期五三、补体结合试验补体的滴定补体不稳定，每次试验前需滴定管号1：60补体钙镁盐水（ml)2U抗原(ml)1％致敏SRBC(ml)结果10.040.260.10.2不溶20.060.240.10.2不溶30.080.220.10.2微溶40.100.200.10.2微溶50.120.180.10.2全溶60.140.160.10.2全溶70.140.