氧化抗氧化失衡与血管性痴呆早期海马CA1区神经元损伤

作者简介：李宁(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：缺血性脑卒中分子机制。E，Tel通讯作者：王瑞敏，Email：ruimin-wang@163.com，Tel：03153725712国家自然科学基金资助项目（31171354），唐山市科技局项目(13130294z)氧化/抗氧化失衡与血管性痴呆早期海马CA1区神经元损伤李宁，朱莹，张文丽，代永鑫，王瑞敏*（063000河北华北理工大学医学实验研究中心神经生物学研究所，唐山市老年医学重点实验室)[摘要]目的探索永久性结扎双侧颈总动脉(BCCAO)后1h至21d海马CA1区神经元氧化/抗氧化平衡的变化，以揭示血管性痴呆早期神经元损伤的分子机制。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham）和BCCAO（1h,1d,3d,7d,21d）组，采用激光共聚焦或westernblot技术检测海马CA1区氧化应激损伤的标志蛋白和抗氧化应激损伤蛋白的变化，采用透射电镜技术观察BCCAO对海马CA1区神经元、血管/星形胶质细胞超微结构的影响。结果=1\*GB3①与sham相比，BCCAO后1h，1d、3d，7d，21d氧自由基探针HEt荧光强度呈时间依赖性增强；免疫荧光双染色及westernblot技术显示过氧亚硝酸(HOONO)自由基标志蛋白3-NT、膜脂质损伤标志蛋白4-HNE水平于BCCAO后7d、21d较sham组显著增加（P<0.05）；=2\*GB3②抗氧化损伤的转录因子Nrf2及其下游抗氧化产物SOD2、HO-1于BCCAO7d、21d较sham组显著降低；=3\*GB3③电镜结果显示，BCCAO后1h、3d和21d海马CA1区神经元、血管及星形胶质细胞均有不同程度损伤，并且于21d损伤最严重，出现染色质边集、核膜溶解，线粒体空泡样变，内质网严重扩张，血管周围严重水肿等病理改变。结论血管性痴呆早期海马CA1区神经元损伤呈现时间依赖性增加，其机制可能与BCCAO后细胞内氧化/抗氧化失衡密切相关。[关键词]血管性痴呆，海马，氧化应激，Nrf2［中图法分类号］R3［文献标识码］AOxidant/AntioxidantImbalanceandHippocampalCA1NeuronalInjuryintheEarlyStageofVascularDementiaLiNing,ZhuYing,ZhangWenli,DaiYongxin,WangRuimin*(NeurobiologyInstituteofMedicalResearchCenter,TangshanKeyLaboratoryofGeratricMedicine,InternationalScience&TechnologyCooperationBaseofGeriatricMedicine,NorthChinaUniversityofscienceandtechnology,57thJiansheSouthRoad,Tangshan,Hebei063000,China)[Abstract]ObjectiveToexplorethechangeofoxidant/antioxidantbalancefrom1hto21dafterBCCAO(bilateralcommoncarotidarteryocclusion)inhippocampalCA1region,andfurthertorevealthemolecularmechanismofneurondamageintheearlystageofvasculardementia

.MethodsAdultmaleSprague–DawleyratsweresubjectedtopermanentBCCAOandrandomlyassignedintosixgroups:sham(sham-operated)groupandBCCAOgroups(1h,1d,3d,7d,21d).Themarkersofoxidativestressdamageandanti-oxidantslevelweredetectedinhippocampalCA1regionbylaserscanningconfocalmicroscope(LSCM)andWesternblotanalysis.TheultrastructionsofNeuron,vascular/astrocytewereobservedafterBCCAOinhippocampalCA1regionbytransmissionelectronmicroscopy(EM).ResultsComparedwithshamgroup，thefluorescenceintensityofHEt,anoxygenfreeradicalprobeafterBCCAO1h,3d,7dand21dincreasedintime-dependentmanner.Doubleimmunofluorescentstainingandwesternblotresultsindicatedthatlevelsof3-NTand4-HNEweresignificantlyincreasedinBCCAO7dand21dgroupscomparedwithshamgroup(P<0.05).=2\*GB3②Comparedwithshamgroup,levelsofNrf2anantioxidanttranscriptionfactoranditsdownstreamoxidationproductsSOD2,HO-1significantlydecreasedinBCCAO7dand21dgroups(P<0.05).=3\*GB3③Ultrastructuralanalysisrevealedthatdifferentdegreeofneuron,vascular/astrocytedamagewasfoundat1h,3dand21dafterBCCAOinhippocampalCA1region.AndthedamagewasthemostseriousinBCCAO21dgroup,showingthepathologicalchanges,suchaschromatinedgeaccumulation,dissolvednuclearmembrane,swollenmitochondria,dilatationofendoplasmicreticulum,aswellassevereedemaaroundthebloodvessels.ConclusionThedamageofhippocampalCA1neuronwasintime-dependentmannerat1h,1d,3d,7dand21dafterBCCAOandthemechanismmightbeclosetotheoxidation/antioxidationimbalanceintheearlystageofvasculardementia.［Keywords］vasculardementia;hippocampus;oxidativestress;Nrf2.SupportedbytheGeneralProgramofNationalNaturalScienceFoundationofChina(31171354)andTangshanScienceandtechnologyBreau(13130294z)Correspondingauthor:WangRuimin,Tel:03153725712,E-mail:ruimin-wang@163.com________________________[基金项目]国家自然科学基金资助项目（31171354），唐山市科技局项目(13130294z[通信作者]王瑞敏，电话：03153725712，E-mail:ruimin-wang@163.com永久性结扎双侧颈总动脉（BilateralCommonCarotidArteriesOcclusion，BCCAO）是目前最常用的血管性痴呆（vasculardementia,VD）模型。据文献报道，大鼠行BCCAO后2.5h内大脑皮层血流降为正常对照组的35-45%，海马区为对照组的60%左右；术后1周逐渐恢复，但直至4周仍显著低于对照组[1,2]。大脑长期处于缺血性低灌注状态会导致神经元发生迟发性坏死，并诱发痴呆。因此，研究BCCAO后慢性低灌注早期的分子机制并及早进行对症治疗，可有效防止VD的出现和加重。氧化应激是由机体内产生的活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）介导，导致氧化与抗氧化失衡，从而引起组织、细胞的氧化损伤[3]。氧化应激在多种神经变性疾病的发病机制中发挥着重要作用，其中包括阿尔茨海默病、帕金森病和缺血性脑卒中等[4,5]。本研究采用间断性结扎大鼠双侧颈总动脉方法制备慢性低灌注模型，探索VD早期海马CA1区氧化与抗氧化平衡的变化，揭示VD发生、发展的分子机制。1材料与方法1.1主要试剂主要一抗：Nitrotyrosine（3NT,sc-65385），4HNE(Ab46545),Nrf2（sc-722），SOD2（sc-18503），HO-1（sc-1797），NeuN（MAB377），β-actin（sc-81178）；荧光二抗：驴抗小鼠Alexa-Fluor488，驴抗羊Alexa-Fluor568，驴抗兔Alexa-Fluor647（Invitrogen）；碱磷酶标记二抗：羊抗兔IgG、驴抗羊IgG、兔抗小鼠IgG（SantaCruz）。BCIP/NBT显色试剂（Promega），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物试剂公司）。1.2实验动物模型制备及分组FPF级成年雄性SD大鼠（250～300g），购自北京华阜康生物科技股份有限公司(许可证编号：SCXK京2004-0004)。经Morris水迷宫筛选学习记忆能力正常的大鼠用于本研究，并随机分为六组：假手术（Sham）组、双侧永久性颈总动脉结扎（BCCAO）1h、1d、3d、7d、21d组。除Sham组外，其余各组均采用间隔7d分2次永久性结扎大鼠双侧颈总动脉；假手术组只分离但不结扎双侧颈总动脉，其余步骤与模型组相同。1.3蛋白样品制备BCCAO后不同时间迅速处死大鼠、断头取脑、沿海马裂分离出CA1区，并置液氮中冻存、备用。以下操作均在冰水浴中进行，从液氮中取出组织，加入1.5ml匀浆裂解液匀浆，4℃，800g离心20min，移取上清液于4℃，17000g离心15min，弃沉淀，吸取上清液即为胞浆蛋白。采用BCA法检测蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白。50μg蛋白经7.5%SDS聚丙烯凝胶电泳分离后以湿转法电转移至PVDF膜上，3%BSA封闭1h，一抗Nrf2(1:200)、SOD2(1:200)、HO-1(1:200),β-actin(1:1000)，4ºC过夜，TBST洗膜，加入相应的碱磷酶标记的二抗室温孵育2h，TBST洗膜，NBT/BCIP显色。1.4免疫荧光染色按本室已经建立的方法[6]，大鼠经过20%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速开胸暴露心脏，经心脏快速灌注温生理盐水后，断头取脑置4%多聚甲醛后固定4-6h。30%蔗糖脱水至组织完全下沉。OCT包埋后冷冻切片机连续冠状切片（25μm）。切片用0.1MPBS洗涤10min×3次。0.4%Trition-PBS打孔15min。10%驴血清封闭1h。加相应的一抗，4℃孵育过夜。0.1%Trition-PBS洗涤10min×3次，加对应的荧光二抗，室温避光孵育1h，0.1%Triton-PBS洗涤10min×3次，贴片，甘油-PBS封片。激光扫描共焦显微镜观察，采集图像｡1.5透射电镜观察大鼠海马CA1区细胞超微结构参照本室建立的方法[7]。用20%水合氯醛麻醉大鼠，生理盐水、4%多聚甲醛心脏灌注后快速取脑，在冰上切取大鼠海马CA1区约1mm3组织块，迅速放入预冷的0.1%戊二醛固定液中4℃过夜。1%锇酸室温固定2h，丙酮逐级脱水，树脂包埋。LKB-I型切片机做超薄切片，厚度为60-70nm，枸橼酸铅染色，透射电镜观察大鼠海马神经元的超微结构。1.6数据处理实验数据以均数±标准误（mean±SE）表示，用SigmaSTAT32统计分析，采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法（LSD），实验组之间比较采用q检验（Newman-keulstest)，P<0.05为统计学有显著性差异。免疫印迹条带经扫描后，用ImageJ(Version1.30v;WayneRasband,NIH,USA)分析软件作灰度分析，SigmaPlot10.0作图。2结果2.1BCCAO早期海马CA1区氧化应激指标的变化A激光共聚焦结果显示（图1A），与假手术组相比，BCCAO各组活性氧自由基荧光探针HEt原位荧光强度均显著增强，21d最强。免疫荧光双染色结果显示（图1A）活性氮自由基标志性蛋白3-NT（3-NT,Green；NeuN,Red）于BCCAO各组较sham组明显增强；脂质氧化损伤标志蛋白4-HNE（4-HNE,Red；NeuN,Green）于BCCAO后3d、7d和21d较sham组显著增强。Westernblot结果显示（图1B），3NT蛋白水平于BCCAO后1-21d各时间点较sham组显著升高，4HNE蛋白水平于BCCAO后3d、7d和21d与sham组相比显著升高，统计具有显著性差异（P<0.05）。ABB图1BCCAO对海马CA1区神经元氧化应激损伤标志蛋白的影响Figure1TheeffectsofBCCAOonmarkersofoxidativestressinjuryinhippocampalCA1region.(A)RepresentativehippocampalCA1sectionsfromsham,BCCAO1h,3d,7dand21dweresubjectedtofluorescencestainingforHEtordoubleimmunofluorescentstainingforNeuNwith3NT(Green),4HNE(Red);(B)Totalproteinextractswerewesternblotanalysisfor4HNE,3NTatindicatedtimepoints.β-actinwasasloadingcontrol.Datawasexpressedasratiotoβ-actinandtheanalysiswasrepresentedbymeans±SEfromfourdependentanimals.*P<0.05vs.shamgroups.Scalebar,50μm;Magnification,40×2.2BCCAO早期海马CA1区抗氧化转录因子Nrf2图2AWesternblot结果显示，sham组和BCCAO1h、1d组海马CA1区Nrf2蛋白表达较高，BCCAO3d略有降低，与sham组相比无统计学意义（P>0.05）。然而，BCCAO7d、21d组Nrf2蛋白水平与sham组相比均显著降低（P<0.05）。图2B免疫荧光双染色结果显示，在sham组Nrf2（绿色）免疫表达主要在细胞浆，而BCCAO1h组可见Nrf2（绿色）与NeuN（红色，生存神经元细胞核标志性蛋白）重叠形成的黄色较sham组显著增强；BCCAO21d组Nrf2免疫染色较sham组和BCCAO1h组显著减弱。图2BCCAO对海马CA1区Nrf2蛋白水平的影响Figure2EffectofBCCAOonNrf2proteinlevelinhippocampalCA1region(A)Totalproteinextractsfromindicatedtime-pointsafterBCCAOweresubjectedtowesternblotforNrf2.Datawasexpressedasratiotoβ-actinandtheanalysiswasrepresentedbymeans±SEfromfourdependentanimals.*P<0.05vs.shamgroups.(B)RepresentativehippocampalCA1sectionsfromsham,1hand21dafterBCCAOweresubjectedtodoubleimmunofluorescentstainingforNeuN(Red)andNrf2(Green),noticedthatNrf2predominantlylocalizedincytoplasminshamgroup,butco-localizedwithNeuNinBCCAO1h.ColocalizationofNrf2andNeuNisdemonstratedbyyellowfluorescence.WeakfluorescenceforNrf2inBCCAO21dperfectlymirroredtheresultofwesternblot.Scalebar,50μm;Magnification,40×2.3BCCAO对Nrf2下游抗氧化蛋白SOD2、HO-1表达的影响如图3westernblot结果显示，BCCAO后1h，1d和3dSOD2蛋白水平较sham组显著升高，BCCAO后7d显著降低，21d组SOD2水平较sham组显著降低（P<0.05）。HO-1在BCCAO后1h、1d较sham组略有升高（P<0.05），随后BCCAO3d、7d、21d均显著降低（P<0.05）。β-actin在各组的表达均无显著差异。图3BCCAO对海马CA1区抗氧化蛋白SOD2和HO-1水平的影响Figure3EffectofBCCAOonlevelsofantioxidantenzymesSOD2,HO-1inhippocampalCA1regionTotalproteinextractsfromsham,1h,1d,3d,7d,and21dafterBCCAOweresubjectedtowesternblotforSOD2,HO-1andβ-actin.Datawereshownasmean±SEfromindependentanimals(n=4)andexpressedasratiotoβ-actin.*P<0.05vs.shamgroups.2.4BCCAO对海马CA1区神经元及血管、星形胶质细胞超微结构的影响透射电子显微镜结果显示，sham组海马CA1区神经元形态及染色质正常，胞质丰富，内质网、线粒体结构基本完整；血管基膜均匀一致，完整性良好,内皮细胞间的紧密连接完整；星形胶质细胞周边足突与血管连接紧密，结构正常。模型组各个时间点海马CA1区神经元、血管及星形胶质细胞均可见不同程度的超微结构改变。

BCCAO后1h和3d组染色质减少，胞浆液化，线粒体脊断裂、空泡化；血管内皮细胞向向外伸出许多突起，附近的星形胶质细胞伪足肿胀，线粒体空泡化。BCCAO21d海马CA1区神经元染色质边集、核固缩，胞质液化，大量线粒体空泡化，内质网严重扩张；血管外严重水肿，基底膜不均匀，紧密连接严重受损，星形胶质细胞胞浆电子密度升高，伪足与血管结构疏松。图4BCCAO对海马CA1区神经元、血管/星形胶质细胞超微结构的影响Figure4EffectsofBCCAOontheultrastructionsofneuron,vascular/astrocyteinhippocampalCA1regionUltrastructuralanalysisrevealsalteredNeuronalNucleus(Bluearrow),Mitochondria(Redarrow),Vascular(Greenarrow)andAstrocyte(Yellowarrow).3讨论氧化应激损伤是在机体受到有害刺激时，由于体内高活性物质产生过多，氧化程度远超出了机体清楚氧化物的能力，使体内氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致了组织损伤[8]。本研究首先采用HEt荧光原位检测BCCAO后海马CA1区神经元O2−自由基水平，结果发现HEt的荧光强度随时间依赖性增强，提示BCCAO触发了海马CA1区神经元的氧化应激信号。因为活性氮自由基可与活性氧族联合作用产生硝化应激，进一步损伤细胞，所以本研究采用NeuN和3NT免疫荧光双染色及westernblot分别检测海马CA1区硝化应激标志蛋白3NT的蛋白水平。结果显示BCCAO后7d和21d海马CA1区3NT蛋白表达较sham组显著升高。细胞膜脂质过氧化损伤是细胞反应氧化应激的早期损伤事件，4HNE为膜脂质损伤的标志蛋白[9]。本研究共聚焦结果及westernblot结果均显示4HNE水平于BCCAO后3d、7d、21d持续升高，并均显著高于sham组。以上结果提示，BCCAO可诱导海马CA1区活性氧和活性氮的持续增加，并导致了海马CA1区神经元膜脂质损伤。Nrf2/ARE是机体抵抗内外界氧化应激最重要的防御性系统。正常生理情况下，Nrf2被Keap1锚定在细胞浆，并被泛素化或蛋白酶所降解[10]；当发生氧化应激时，Nrf2与Keap1蛋白解耦连，转入细胞核，与抗氧化应激顺式作用元件(antioxidantresponsiveelements，ARE)序列结合，诱导其下游抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶的基因的表达[11]。本研究westernblot结果显示，BCCAO后1hNrf2略有上升，但与sham组相比无显著差异，BCCAO7d、21d组Nrf2的蛋白水平较sham组显著降低，Nrf2和NeuN（神经元细胞核标志蛋白）双荧光免疫染色进一步证实了westernblot的结果。有趣的是Nrf2的免疫荧光染色强度在BCCAO1h组和sham组无显著差异，但是在sham组Nrf2与NeuN无共定位，提示Nrf2主要在胞浆表达，而BCCAO1h组Nrf2与NeuN共定位，提示Nrf2于BCCAO1h可能转位到细胞核。为进一步明确Nrf2的抗氧化活性，本研究采用Westernblot技术检测Nrf2下游抗氧化酶超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）和血红素氧合酶1(Hemeoxygenase-1，HO-1)的蛋白表达。SOD2在抗氧化过程中可直接清除自由基，防止机体受到氧化应激损伤，可提示机体的抗氧化能力[12]。HO-1是血红素代谢过程的限速酶，是有效的抗氧化应激调节蛋白，在海马神经元、星形胶质细胞和大脑皮质细胞均高表达[13-15]。研究发现BCCAO后1h到3d海马CA1区SOD2和HO-1的蛋白水平均保持较高水平，但BCCAO7d、21d显著下降，并均较sham组显著降低，此变化趋势与Nrf2的变化相吻合。同时，电镜结果显示，BCCAO后不同时间窗海马CA1区神经元、血管及星形胶质细胞均有不同程度损伤，并于21d损伤最严重。这表明，BCCAO后海马CA1区神经元、血管及星形胶质细胞的损伤可能与氧化应激有关，并具有时间依赖性。综上所述，本研究结果发现BCCAO后活性氧和活性氮的逐渐增加导致了海马CA1区神经元膜脂质损伤，而同时抗氧化物质Nrf2、SOD2和HO-1表达相对降低，最终氧化-抗氧化失衡导致了神经元超微结构损伤。此研究为血管性痴呆的早期预防和治疗提供了重要的时间窗及探索新策略提供重要的理论依据。参考文献：[1]UlrichPT,KroppenstedtS,HeimannA,KempskiO.Laser-Dopplerscanningoflocalcerebralbloodflowandreservecapacityandtestingofmotorandmemoryfunctionsinachronic2-vesselocclusionmodelinrats[J].Stroke,1998,29(11):2412-2420.[2]OtoriT,KatsumataT,MuramatsuH,etal.Long-termmeasurementofcerebralbloodflowandmetabolisminaratchronichypoperfusionmodel[J].ClinExpPharmacolPhysiol,2003,30(4):266-272.[3]OckCY,KimEH,ChoiDJ,etal.8-Hydroxydeoxyguanosine:notmerebiomarkerforoxidativestress,butremedyforoxidativestress-implicatedgastrointestinaldiseases[J].WorldJGastroenterol,2012,18(4):302-308.[4]SmithJA,ParkS,KrauseJS,etal.Oxidativestress,DNAdamage,andthetelomericcomplexastherapeutictargetsinacuteneurodegeneration[J].NeurochemInt,2013;62(5):764-775.[5]Diaz-RuizA,Vacio-AdameP,Monroy-NoyolaA,etal.Metallothionein-IIinhibitslipidperoxidationandimprovesfunctionalrecoveryaftertransientbrainischemiaandreperfusioninrats[J].OxidMedCellLongev,2014,2014:436429.[6]WangR,TuJ,ZhangQ,etal.GenisteinattenuatesischemicoxidativedamageandbehavioraldeficitsviaeNOS/Nrf2/HO-1signaling[J].Hippocampus,2013,23(7):634-647.[7]ZhouC,TuJ,ZhangQ,etal.DelayedischemicpostconditioningprotectshippocampalCA1neuronsbypreservingmitochondrialintegrityviaAkt/GSK3betasignaling[J]