生物工程制药之生物转化

关于生物工程制药之生物转化第1页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五

酶作为一种生物催化剂是神奇的，它的参与使无法完成的有机合成反应成为可能。立体和选择性催化是其精华所在。生物转化第2页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化

生物转化(biotransformation)是利用微生物及其细胞器、植物离体细胞或器官、动物细胞以及游离酶对外源性化合物(exogenoussubstrate)进行结构修饰的生化反应。微生物转化可用完整的微生物细胞或从微生物中提取的酶作为生物催化剂。

FDA将这类产品列入天然产品,这为生物转化及天然发酵产物的市场化提供了一个很好的软环境。第3页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化

生物转化是生化工程、酶工程、基因工程等交叉的技术，与有机化学合成紧密地结合在一起第4页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化

对于复杂结构的天然活性成分来说,利用化学合成来进行结构修饰存在着得率低,反应专一性差、副产品多等缺点,生物转化技术却可弥补化学合成的不足。

至今生物转化已涉及羟基化、环氧化、脱氢、氢化等氧化还原反应、水解、水合、酯化、酯转移、酰化、脱羧、脱水、异构化等各类化学反应。生物转化技术最关键最困难之处在于获得转化反应所需的菌株或酶。一旦获得了适当的生物催化剂,生物转化将不成问题。第5页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1生物转化在制备D-氨基酸在自然界中D-氨基酸相对稀少,被冠以“非天然”氨基酸之称,但D-氨基酸在医药、农药和食品等的组成中起着重要的作用,特别是它们已被用于合成β-内酰胺类抗生素和生理活性肽。第6页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1生物转化在制备D-氨基酸众所周知自然界中存在20种基本氨基酸,除甘氨酸外都有2种互成镜像的对映体D型和L型,历来认为生命物质只存在L型氨基酸,并曾将L型冠以“天然”,而D型就成了“非天然”。与L-氨基酸相比,D-氨基酸种类少,只占自然界已发现的300多种氨基酸的10%左右,但其价格十分昂贵。第7页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1生物转化在制备D-氨基酸

随着分析方法的发展,人们相继在海洋动物、陆生动物、脊椎和无脊椎动物、种子植物和人体中发现了各种D-氨基酸之后,D-氨基酸才引起人们的高度重视,并意识到它们在医药、农药和食品等的重要组成中起着重要作用。第8页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1生物转化在制备D-氨基酸人体的一些疾病与体内D-氨基酸的含量有关,诸如白内障晶体浑浊、早老年痴呆症以及某些肾脏疾病的病人,其体内某些组织中D-氨基酸含量均高于正常人,D-氨基酸还会阻断一些重要生物物质的合成,从而抑制了动物的生长。D-氨基酸对研究某些疾病和衰老机制十分重要,此外D-氨基酸已被用于β-内酰胺类抗生素和生理活性肽的生物合成。第9页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1生物转化在制备D-氨基酸5.1.1生物转化法制备D-氨基酸一般来讲D-氨基酸要靠合成制得,但各种合成法均有缺陷，有的合成步骤较长,有的手性助剂价格昂贵,有的光学纯度达不到要求等。

第10页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1.1.1由DL-丙氨酸生产制备D-丙氨酸生物催化剂:麦芽假丝酵母。原理:麦芽假丝酵母能不对称降解DL-丙氨酸,降解L-丙氨酸的速度比降解D-丙氨酸的速度快10倍,从而除去L-丙氨酸,积累D-丙氨酸。工艺:加入200g/LDL-丙氨酸作为底物,麦芽假丝酵母在30℃、pH6.0、通风量1.0vvm和1200r/min的最适条件下,经40h后L-丙氨酸完全降解。结果:经分离后,最终得99.0%的化学纯和99.9%光学纯度的D-丙氨酸。第11页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1.1.2恶臭假单孢菌产生的二氢嘧啶酶原理:二氢嘧啶酶（D-海因酶）,只催化D-型海因、嘧啶水解,生成N-氨甲酰-D-氨基酸,对L型海因、嘧啶不被水解。工艺:用醛为原料,经Bucher反应合成DL-5-取代乙内酰脲,然后用恶臭假单孢菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N-氨甲酰-D-氨基酸,再经化学或酶法脱氨甲酰基得D-氨基酸。结果:由DL-5-取代乙内酰脲生产D-对羟基苯甘氨酸,收率达92%。第12页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化第13页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1.2酶法拆分原理:外消旋氨基酸先生成其衍生物如外消旋酯、酰胺,然后被酶或微生物选择性水解成旋光纯氨基酸,再通过常规化学物理方法从反应混合物中分离。酶法拆分常用的酶有脂肪酶、酯酶和蛋白酶等水解酶。缺点:1)反应过程中产生的L-氨基酸积累到一定程度会抑制进一步拆分,因而降低了摩尔分率;2)底物在发酵液中溶解度低,限制了生产能力;3)酶的稳定性差;4)有些酶要求反应底物浓度极稀,反应时间长,不利于大规模生产第14页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1.2酶法拆分优化:固定化生物催化剂因其能反复利用,使用寿命较游离酶有明显提高,可极大地降低成本,在氨基酸拆分中得到了成功的应用。第15页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.1.2酶法拆分手性流动相拆分

普通色谱固定相也用于DL-氨基酸的色谱拆分,但需要在流动相中加入手性络合物修饰剂。手性流动相拆分法中手性络合物的配体多为L-氨基酸及其衍生物,手性络合物的金属离子多为Cu2+或Ni2+。流动相中手性络合物的浓度一般以1～10mmol/L为宜,流动相pH为5左右。第16页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.2生物转化合成抗生素5.2.1氨苄青霉素的生产酶法转化氨苄青霉素由三步反应组成1）酶转化青霉素为6-氨基青霉烷酸（6-APA）2）酶转化氨苄青霉素的侧链（如D-苯甘氨酸、D-对羟基苯甘氨酸）3）酶法连接侧链到青霉素母核6-APA第17页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.2.1氨苄青霉素的生产第18页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.2.1氨苄青霉素的生产第一步将青霉素G酰胺酶固定化，载体为环氧丙烯珠状聚合体。（经过500次循环仍保持90%以上的酶活）第19页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.2.1氨苄青霉素的生产第二步侧链的制备1）合成DL-苯基甘氨酰胺2）采用微生物胺肽酶选择性催化DL-苯基甘氨酰胺键断裂，拆分产生L-苯甘氨酸和D-苯基甘氨酰胺。3）用苯甲醛形成不溶性西夫碱将D-苯基甘氨酰胺从反应混合物中分离4）用酸水解后获得没有外消旋的D-苯甘氨酸第20页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.2.1氨苄青霉素的生产第三步青霉素G酰化酶将侧链连接到母核第21页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.2生物转化合成抗生素5.2.2阿莫西林的生产第22页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3生物转化技术在天然药物研究开发中的应用

5.3.1青蒿素的微生物转化修饰第23页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化青蒿素是1971年从药用植物黄花蒿(ArtermisiaannuaL.)中分到的一个具有过氧桥的倍半萜类化合物,具有快速、高效、低毒的抗疟活性,目前,全球共有25亿人口处于疟疾的威胁之中。青蒿素及其衍生物蒿甲醚、双氢青蒿素及青蒿酯钠在我国已广泛应用于临床。同时,世界卫生组织正在开发研究蒿乙醚。第24页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化

许多科研工作者试图通过结构改造,提高药物疗效,以提高青蒿素的资源利用率。迄今为止已制备了数百个青蒿素的衍生物,并筛选出双氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿虎酯及青蒿酯钠等几个高效抗疟衍生物，但是由于青蒿素的有效活性基团过氧桥的不稳定性,使得对青蒿素结构改造无法在酮基以外的部位进行,目前可用的有机化学改造方法主要停留在对酮基的还原。第25页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化

从发酵产物中分离得到了16个转化产物并鉴定了其中14个结构,其中10个为新化合物。这14个转化产物中除一个为羰基化产物外,其余13个都是羟基化产物,极性都大于底物。这些化合物都是用化学方法无法制备的。

第26页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3生物转化技术在天然药物研究开发中的应用其中9个新化合物为:9α-羟基青蒿素,9β-羟基青蒿素,青蒿酮-9,9α-羟基双氢青蒿素,9α-羟基-α-双羟基青蒿素,2α-羟基双氢青蒿素,2α-羟基-α-双氢青蒿素,9α、9β-二羟基去氧蒿甲醚,2α、9β-二羟基蒿甲醚,2α、9α-二羟基蒿甲醚。第27页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.2稀有人参皂甙的微生物转化以人参皂甙为原料,从野山参生长的土壤中分离筛选菌种,利用这些菌种对总皂甙进行了发酵,制备了具有抗肿瘤、抗血栓等强生物活性的稀有人参皂甙。第28页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.2稀有人参皂甙的微生物转化

人参皂甙(约为30余种)按甙元结构分为三类:齐墩果酸类、原人参二醇及原人参三醇类。人参皂甙Rh1、Rh2、Rh3、Rg3

、Rg5虽然含量仅为十万分之一,但生理活性却很高,如Rg3、Rg5具有很好的抗癌、抗血栓和软化血管的疗效,临床实验证明Rg3对多种实体瘤的抑制率可达60%,对肺肿瘤的抑制率为70%～80%,抑制肺癌小细胞(OC10)胰腺癌细胞(PSN-1)的生长;人参皂甙Rh2能抑制人卵巢癌、morris肝癌、人子宫颈癌、B16黑色素瘤、HELA细胞的增殖,抑制人早幼粒白血病HL60瘤株,使培养的癌细胞表型逆转等。利用发酵转化的技术使Rg3的转化率达到了3%～5%、Rh2的转化率也达到了1%～2%。第29页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.2稀有人参皂甙的微生物转化GinsenosideRg3第30页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.3微生物转化喜树碱衍生物同喜树碱相比,10-羟基喜树碱以疗效好,毒性低较为常用,但含量仅为万分之几。在喜树的总生物碱中喜树碱为主要成分,10-羟基喜树碱仅占十万分之二,依靠从天然资源中提取则费时、费力、浪费资源。研究发现利用曲霉等多种微生物能将喜树碱定向转化成10-羟基喜树碱,为解决资源问题闯出了新路。第31页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.3微生物转化喜树碱衍生物10

-hydroxycamptothecineR=OH第32页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4生物转化技术在甾体药物研究开发中的应用微生物对类固醇和固醇底物的氧化还原反应，使我们对生物转化的区域选择性和立体选择性留下了特别深刻的印象，并证明酶具有促进碳氢化合物未活化中心区域反应的能力。第33页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.1类固醇母核碳架结构第34页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4生物转化技术在甾体药物研究开发中的应用5.4.1类固醇母核碳架结构由A、B、C、D四个环组成，并不在一个平面上，其生物活性决定于附着在系统上的基团定位。

C6基团凸出类固醇平面之上的构型命名为β构型，它们和环系统的联系用实线表示；那些投影在平面之下的构型称为α构型，它们和环的连接用点线表示。第35页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展甾醇类或类固醇化合物（steroids）是广泛分布于自然界的物质，作为激素可以调节动植物的生命代谢，同时也有助于脂类的消化和吸收以及抗炎、抗毒素等作用。它们以环戊烷多氢菲（cyclopentanoperhydrophenanthrene）为基本结构，其中一大类称为甾醇类（sterols，或固醇类）化合物，如豆甾醇（stigmasterol，见图1）和麦甾醇（sitosterol），上述这些甾醇是目前微生物转化的重要前体物质。

第36页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展图1.豆甾醇（Stigmasterol）

第37页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展关于微生物转化甾体类物质的研究最早可以追溯到20世纪30年代，Mamoli和Vercellone在研究酵母菌发酵时发现，该菌可以将17-ketosteroids还原为17β-hydroxystreroids，这种方法在生产雄性荷尔蒙、睾丸激素和雌性激素（如雌二醇）等方面具有重要的过渡意义，但之后迅速被高效、廉价的非酶合成方法取代。

第38页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展虽然开始时微生物转化的甾体类物质没有能够成功的工业化，但Mamoli等对甾体类物质的生物转化基础和发现性研究具有划时代的意义，之后的1940-1949年，成立的Mamoli学院继续在该领域的研究。第39页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展

1952年在美国厄普强药厂（Upjohn）成功地利用无根根霉实现了由黄体酮到11α-羟基黄体酮的工业化过程，从此，微生物转化甾体类药物得到了人们广泛的重视。

生物转化第40页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展一个有重要意义的药物——可的松，也是在20世纪30年代，马约基金会的EdwardC.Kendall和巴塞尔大学的TadeusReichstein分离到了由肾上腺分泌的可的松（共同获得1950年的诺贝尔奖）。1949年，马约基金会的研究者们发现服用可的松可以减缓急性风湿性关节炎的症状，对可的松的大规模需求，极大地刺激了化学合成激素技术的发展。

第41页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展最初化学合成可的松是一个需要31步反应的复杂过程，而且收率很低，615kg的脱氧胆酸只能得到1kg的可的松醋酸酯，其市场价格在当时是200美元/g。该合成工艺的主要难点在于将脱氧胆酸C12β羟基转化至C11上，需要9步化学合成反应。第42页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展

Murray和Peterson等成功地采用微生物转化的方法一步完成了上述转化过程，几乎在同时施贵宝（Squibb）研究所的科学家也发现一种黑曲霉也能完成同样的转化，采用微生物羟化C11技术后，工业合成可的松的反应步骤由31步缩短到11步，使可的松的市场价格降至6美元/g。第43页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展合成可的松的最初底物是由牛胆汁中纯化得到的，因此价格很昂贵，可的松工业化过程的又一次质变则根源于此，即由廉价的甾醇代替脱氧胆酸，其依托的技术仍然是微生物转化。第44页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展甾醇类物质，如前面提到的豆甾醇（图1）和谷甾醇，是大豆油生产中的副产物，可以大量获得，市场价格在20美元/kg左右。另外还有的植物甾醇是由多花薯蓣根得到的薯蓣皂苷等，从这些植物甾醇生产类固醇必需除去C21位上连接的侧链，生成雄甾烯酮类物质，如雄烯二酮（4-AD，图2）。尽管采用化学降解等方式可以完成上述反应，但采用微生物转化技术更加具有优势。至20世纪80年代，可的松的价格已经达到0.46美元/g。第45页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展图2.雄烯二酮（4-AD）第46页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.2甾醇类或类固醇化合物的生物转化发展通过甾体药物分析，众多的甾体药物结构被阐明，在这些甾体类有机化合物中存在着旋光、手性、分子不对称性、消旋异构和立体异构等现象，单纯采用有机合成方法完成这些立体专一性或对映选择性反应是非常困难，甚至是不可能的。生物转化过程中酶反应具有的高度专一性和高效性保证了酶促反应产物立体异构的唯一性，同时常温、常压的生物转化过程比高温、高压和非水溶剂的合成体系费用更低和易操作。第47页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.3.4.3一些的甾体药物合成的相互关系第48页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4生物转化技术在甾体药物研究关键酶5.4.1关于细胞色素P450

细胞色素P450是一类以还原态与CO结合后在波长450nm处有吸收峰的含血红素的单链蛋白质。它于1958年被发现,引起了人们的广泛重视。近年来每年发表的有关细胞色素P450的研究论文已超过2000篇。细胞色素P450之所以引起人们极大兴趣是因为它在生物体中具有重要的功能——对许多内源性和外来物质都存在代谢作用。它的广泛分布、多样的结构、复杂的功能及其基因的多层次调控可以说是其重要性的一些体现。

第49页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4.1关于细胞色素P450

膜结合细胞色素P450可分为微粒体和线粒体细胞色素P450两种类型。线粒体细胞色素P450具有严格的底物专一性,它代谢内源性甾醇类物质,对外来物质无代谢作用。而其它细胞色素P450特别是肝微粒体中的细胞色素P450则具有非常宽而重叠的底物专一性。第50页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4.1关于细胞色素P450细胞色素P450是分子量为40～

60kD、结构类似的一族蛋白质。近年来,不断有新的成员归入细胞色素P450这一古老的基因超家族,至今已鉴定出400多种来自植物、动物、细菌和酵母的细胞色素P450。Coon等指出细胞色素P450这一习惯沿用的名称已不能很好地表示这一类物质，而提出用多样酶类(diversozymes)来命名这一血红蛋白家族。第51页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4.1关于细胞色素P450人类制造的环境化合物,估计已超过200000种,其中大多数是细胞色P450的可能底物,还有许多可能作为细胞色素P450不同同工酶的诱导剂或抑制剂。有些参与甾醇转化的细胞色素P450对底物有高度选择性,而其它细胞色素P450特别是肝微粒体的细胞色素P450具有重叠的底物专一性。

第52页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4.2细胞色素P450催化机制总体看,细胞色素P450可以催化成千上万的反应,甚至对具有相似化学结构的底物也表现出多种反应类型。细胞色素P450催化反应过程涉及多个步骤,其作用机制有多种。典型的反应是通过电子传递系统将分子氧还原,并将其中一个氧原子加到底物(RH)中,反应需NADPH。RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+第53页，共61页，2022年，5月20日，11点8分，星期五生物转化5.4.2细胞色素P450催化机制细胞色素P450其它的催化机制,如:1)在