生化仪检测原理及应用

关于生化仪检测原理及应用第1页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五生化分析技术基本原理：

第2页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五1：反射分析技术原理：仪器内部光源发出一束光透过透明支持层，在试剂层光被有色化合物部分吸收后，在扩散层提供的反射面被反射，反射光经滤光装置后回到光度检测器被读数。光密度由此被转化为电压读数，并计算成分析物浓度。2．散射免疫比浊法技术原理：是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比。3.透射免疫比浊法的技术原理：是测定一定体积的溶液通过的光线量，当光线通过时，由于溶液中存在的抗原抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，测定的光通量和抗原抗体复合物的量成反比。第3页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五化学发光技术基本原理：

1：电化学发光分析技术（ECL）：是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。包括了两个过程，发光底物二价的三联吡啶钌及反应参与物三丙胺在电极表面失去电子而被氧化。氧化的三丙胺失去一个H成为强还原剂，将氧化型的三价钌还原成激发态的二价钌，随即释放光子恢复为基态的发光底物。（发光标记物-三联吡啶钌）代表仪器品牌----德国罗氏CobasE601第4页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第5页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五2：化学发光标记免疫分析：化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridiniumester(AE),是有效的发光标记底物,其通过起动发光试剂(NaOH2H2O2)作用而发光,强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析,其化学反应简单、快速、无须催化剂;检测小分子抗原采用竞争法,大分子抗原则采用夹心法,非特异性结合少,本底低;与大分子的结合不会减小所产生的光量,从而增加灵敏度。代表仪器品牌----美国贝克曼DXC800第6页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五DXC800照片第7页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3.干化学反射分析技术原理及优点：与普通生化仪比较，干化学被测物质的化学反应是在干燥的基质中进行，入射光通过基质被吸收后，检测反射光的减弱程度来反映被测物质浓度的大小。普通生化仪反应载体是水溶液，入射光被有色反应产物吸收后减弱，通过吸光度的大小来反映被测物质浓度的大小。干化学均用一次性消耗品，无交叉污染和携带污染。缺点是：成本比较高。第8页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第9页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五4：生化仪恒温装置---自动生化分析仪通过温度控制系统保持温度的恒定，以保证反应的正常进行，可以对25℃、30℃、和37℃三种温度进行恒温。保持恒温的方式有三种：

空气干式浴恒温：在比色杯与加热器之间隔有空气。优点：方便，速度快，不需要特殊的保护。缺点：稳定性和均匀性稍差。----代表仪器贝克曼DXC800第10页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五水浴式循环加热式：在比色杯周围充盈有水，加热器控制水的温度。

优点：温度准确，可达±0.1℃。

缺点：需要特殊的防腐剂才能保证水质的洁净。

------代表仪器罗氏ModulP800第11页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五恒温液循环间接加热：在比色杯周围流动着一种特殊的恒温液（具有无味、无污染、不变质、不蒸发等特点的能够传导热量的一种介质），在比色杯与恒温液又有一个几毫米的空气夹缝，恒温液通过加热夹缝的空气达到恒温。优点：均匀性、稳定性优于干式，又有升温迅速，不需要特殊保养的优点。第12页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第13页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五5：反渗透纯水系统：原水为自来水，首先经过机械过滤器，去除混在水中的铁锈、砂、红虫、胶体等大颗粒杂质；首级过滤后的水进入活性碳滤器，活性炭对水中的余氯、有机物及异味有极高的去除效果；然后经过软水处理器去除水中造成结垢的钙、镁等离子，变成软水。经过处理后出来的水，再经过5μm保安过滤器，防止预处理滤料微粒及5μm以上的杂质进入反渗透系统，再经高压泵增压1.0MPa或1.5MPa，在此压力下，反渗透析出纯水，然后送到纯水箱。第14页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第15页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五1．级别

分析实验室用水的原水应为饮用水或适当纯度的水。

分析实验室用水共分三个级别：一级水、二级水和三级水。2．一级水一级水用于有严格要求的分析试验，包括对颗粒有要求的试验。如高效液相色谱分析用水一级水可用二级水经过石英设备蒸馏或离子交换混合床处理后，再经o．2pm微孔滤膜过滤来制取。3．二级水

二级水用于无机痕量分析等试验，如原子吸收光谱分析用水。

二级水可用多次蒸馏或离子交换等方法制取。第16页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五4．三级水

三级水用于一般化学分析试验。三级水可用蒸馏或离子交换等方法制取。5．贮存各级用水在贮存期间，其沾污成分的主要来源是容器可溶成分的溶解、空气中二氧化碳和其他杂质。因此，一级水不可贮存，使用前准备.二级水、三级水可适量准备，分别贮存在预先经同级水清洗过的容器中。各级用水在运输过程中应避免沾污。第17页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第18页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五5.2水质常引起的问题：FrequentCalibrations频繁的校正HighCV%高CVFluctuationinqualityresultsovertheday/week/month积累和波动现象Interferedassays直接干扰分析第19页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第20页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五分析仪参数设定及相关资料：第21页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五7600基本设置第22页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五双波长：有两个不同的波长即测量波长（主波长）和参比波长（次波长）。由检测器测出的吸收度是这两个波长下吸收度的差值△A。△A与被测定物质的浓度成正比，这个方法称双波长法。双波长差吸光度法具有可以克服样本混浊（溶血、脂血、黄疸）、共存组分吸收谱线叠加的干扰，以及减少比色杯的光学不均一等优点。

空白(blank)校正:在分光光度法中，常利用空白溶液来调节仪器的吸光度零点，或用来抵消某些测定的干扰因素。

第23页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第24页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第25页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五湿化学常见的比色分析反应类型：直接测量：具有特征性的吸收峰，不经过任何反应直接在指定波长测量；单一反应：待测反应本身有特征性吸收峰的底物或产物量的变化；如ALB测定原理：白蛋白+BCG-----白蛋白-溴甲酚绿复合物溴甲酚绿复合物在波长为570nm处吸光度最强，固此法ALB主波长应设定在570nm；偶联反应：底物或产物无特征性吸收峰，需经过其他反应生成有特征性的吸收峰测量的化合物，这种反应称为指示反应。如ALT测定原理：L-丙氨酸+α—酸戊二酸

丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+

乳酸+NADNADH在340nm处吸光度最强，其吸光度与NADH的浓度成正比，固ALT此法检测主波长应设定在340nm处。第26页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第27页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五一点终点法：当待测物与试剂反应到达平衡，测定其吸光度，计算待测物浓度，该法在标本正常情况下较稳定，若空白对照较大时（如有干扰吸光度物质）影响检测真实值。

第28页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五2、两点终点法：在被测物反应或指示反应未开始时，选择第一个吸光度点，在反应到达平衡后选择第二个吸光度点，两点吸光度点之差用于计算结果。

此法能有效减少标本溶血、脂血、黄疸造成的干扰。

第29页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3、连续监测法：在零级反应期连续测定酶促反应过程中底物或产物量的变化，求出酶反应初速度，间接计算出酶活力浓度。此法主要用于酶活性及其代谢物的测定，较终点法准确。第30页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五4、两点固定时间法：指在时间-吸光度曲线上取尚在反应中的两点间的差值来计算结果，此两点既不是起始点也不是反应终点。

此法应选用酶反应的线性期进行测定，同时还应确定该法能测定酶活性的最高限度，对于超过此限的样品，应采用缩短反应时间或减少样品用量的办进行测定。

第31页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五常见几种报警：

第32页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第33页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第34页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五临床生化检验的校准与质控

第35页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五常用的有Linear单点校准：需要设置一个标准品（浓度必须大于0），以原点和标准品的连线为校准曲线（横坐标为浓度C，纵坐标为吸光度A）。单点校准必须设置空白校准0点。Logistic-Log4P：标准品的数量至少为4个，其中第1个标准品的浓度为0，标准品的浓度必须从低到高的顺序排列。适用于随着浓度的增加需吸光度偏移的实验项目的标准曲线。Spline：此校准方式要求提供2~6个标准品，其中第1个标准品的浓度必须为0，标准品的浓度必须从低到高的顺序排列。计算方法：K因数法（1点线性法）-----由空白液的标准（C1）通过公式计算得出的K因数制成的曲线。K因数法测定C1（空白试剂）的吸光度时，先输入K值，再计算浓度值。

公式：CX=K(AX-B)+C1第36页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五②两点线性法----由空白液和含有一定浓度标准液的标准2的两点吸光度绘制的曲线(Y=aX+b,通过水来计算得到b,通过标准品来得到a.)。此法适用于所有的分析方法：1点法、2点速率法和速率法。常用项目：TP、ALB、TC、TG等

第37页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五多点线性（非线性）----要提供至少4个标准品，第一个为活性为0，然后用二次函数或指数来描绘校准的曲线与公式。X=K/[1+A(Cx+C1)]+S1ABS

X：样本吸光度或吸光度的变化量；Cx：样本浓度；C1：标准液1浓度；常用项目：APOB、APOA、PA等。

第38页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五二：质控

质控的基础就是正态分布图。几个概念：准确度：一个检测结果与可接受的参考值之间的一致程度。(ISO3534-1：1993)正确度：很大一个系列检测结果的均值与可接受的参考值之间的一致程度。(ISO3534-1：1993)。与系统误差有关，常用偏倚(bias)表示不正确度。精密度：在规定条件下独立检测结果之间的一致程度（ISO3534-1：1993）。与随机误差有关，常用SD或CV表示不精密度。第39页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第40页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五靶值与SD的设定:1平均数和标准差质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控品重复测定的基础上。2定值质控品若使用定值质控品，使用说明书上的原有标定值只能作参考。必须由实验室作重测定来确定实际的均值和标准差。3新批号质控品均值的建立新批号质控品的每个项目都应和现用的质控品作平行检测，最好是在不同天内至少作20瓶的检测。若无法从20天内得到20个数值，至少在5天内，每天作不少于4次重复检测来获得。4新批号质控品标准差的建立若在相当长的时间内操作稳定，有大量质控数据，则由此确定的标准差评估值应可用于新批号。但对标准差评估值应定期重新评估。若无较好的资料，则应重新作评估。最好是在20天得到至少20个数据。在以后能有较长的稳定操作的数据时，计算的评估值更好，用其替代前者。5累积值由每个月质控数据对标准差的估计（对均值亦有一定影响）常因检测数的固有困难，造成月与月之间的变异较大（例如：由20个检测数估计标准差，它和标准差真值间的差异可达30%；由100个检测数估计标准，估计值和真值的差异还要大于10%）。较好的估计是将较短时间周期内的质控数据累积起来，例如，累积6个月连续每月质控数据成为6个月累积值。要注意的是作为每个月周期的均值没有持续下降或上升的改变。第41页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3质控统计方法：aL-J质控图(最常用)-----L-J质控曲线，全称Levey-Jennings。1924年，美国休哈特（W.A.Shewhart）首先提出质控图。20世纪50年代，Levey和Jennings把质控图引入到临床检验中。（质控方法是建立在单个质控品双份测定值的均值和极差的基础上）Henry和Segalove对L-J质控图（X-R）进行了修改，以20份质控品的试验结果，计算均值和标准差，定出质控限，每天或每批随患者标本测定质控品一次，将所得的质控结果标在质控图上。这各质控图一般称为单值质控图，也就目前大家所熟悉的L-J质控图。bZ-分数图------z分数（z-score）,也叫标准分数（standardscore）是一个分数与平均数的差再除以标准差的过程.z分数是一种可以看出某分数在分布中相对位置的方法。Z分数是以标准差为单位所表示的原始分数（x）与平均数的偏离，也可以说是一个以标准差为单位来表示的偏离分数。第42页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五Z-分数图就是将不同浓度水平的绘在同一图上。

第43页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五cYouden图------制作双值质控图，是以低值画在水平轴，高值画在垂直轴，形成正方形图，正方形的中心点，即为两个平均值的交叉点。既能区分系统误差及随机误差，也适用于室间质量评价。可分三种形式：稳定型质控图：两种质控品的测定值主要变动于BC之对角线上，集中于Ⅱ、Ⅲ区，呈椭圆形分布。第44页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五随机误差质控图：两种质控品的测定值主要变动于AD之对角线上，集中于Ⅰ、Ⅳ区以及其外侧。第45页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五系统误差质控图：两种质控品的测定值主要变动于BC之对角线上，集中于Ⅱ、Ⅲ区：以及其外侧。第46页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五质控规则的选择

警告（随机误差）失控（随机误差/新的系统误差）第47页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五第48页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五Westgard多规则检索程序：第49页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五3：生化室内质控失控后的处理Westgard多规则注意问题：12S警告规则，不是失控规则。若本批数据无超出±2S限制线（即使数据刚好落在±2S限制线上），表示本批结果没问题。没有出现12S的表现，但数据出现倾向性表现，如多个数据偏于一侧，甚至偏于+1S或-1S以外，这种情况都不属于失控，可根据实验室质量目标要求做相应处理。失控后不恰当的做法：（1）重做控制品（应用12S规则时，1个控制品时的假失控报告可能性为5%，2个控制品为9%，3个控制品是时为14%，当出现12S表现后重做控制品，得到的控制值常在“限值内”，感觉“这次又正好过关了”）---延误了解决误差的时机，将问题留给了以后。（2）试用新的控制品---将问题简单地推给控制品。（3）重新校准---掩盖问题真相。

第50页，共53页，2022年，5月20日，8点37分，星期五失控后比较恰当的