生殖激素的测定-雌节育-68-160310课件

第六节

生殖激素的测定1主要内容（六）一、生物测定法（bioassay）

二、免疫测定法（immunoassay）三、受体测定法四、理化测定方法2一、常规生物测定法生物活性：

某生殖激素按一定比例稀释后

注射到大鼠、小鼠、公鸡等实验动物体内

观察实验动物靶器官对激素的反应一个生物学单位：

实验动物中产生生物学效应的最低激素用量如：大白鼠单位、鸡冠单位3生物测定法种类

1．子宫增重反应2．阴道涂片检查3．鸡冠发育反应4．卵巢增重反应5．排卵试验6．抗坏血酸排空反应41．子宫增重反应雌激素生物学活性测定未成熟、或摘除卵巢2周后的大鼠或小鼠

每组5~7只，每日皮下注射1ng~20ng标准激素

连续注射7d

第8d取出子宫、剥离其附着组织，称重标准曲线：子宫重-纵座标、标准激素用量-横座标待测样本的生物学活性：

待测样子宫重与标准曲线比较52．阴道涂片检查ES测定的另一方法观察ES对阴道上皮的角质化程度ES处理：每隔12h皮下注射1.5~15ng

连续注射三次

最后一次注射激素第24h开始

隔12h作阴道涂片

检查有无角质化的上皮阳性反应的百分比与标准剂量反应曲线比较7HCG的生物活性：

25日龄大鼠间隔8h于皮下注射6次

然后按上述方法可检测

83．鸡冠发育反应

雄激素测定：灵敏度可达0.01mg将待测样本溶解于乙醚

每天在鸡冠上涂搽0.2ml

在第7d后取鸡冠称重冠重直接与雄激素的剂量成正比94．卵巢增重反应

25日龄大鼠，每天于腹腔内注射一次

连续3d，第4d（72h）取出卵巢称重PMSG测定：灵敏度可达2国际单位FSH的测定:

LH或HCG作为协同剂、增强反应105．排卵试验未成熟的仓鼠于出现GTH前12h

静脉注射待测样本

18h后取出卵巢和相连的输卵管

计算洗出的卵子数其数目与GTH的剂量相关测定FSH、HCG和PMSG：

灵敏度0.25mg、0.1和2IU116．抗坏血酸排空反应

假孕（孕酮处理）、或出生后5~9d的大鼠

LH可排除假孕动物黄体中抗坏血酸的原理

测定LH的活性，灵敏度可达0.125g静脉注射待测样本前除去一侧卵巢

3h后除去另侧卵巢

比较两侧卵巢的抗坏血酸含量两者间差与剂量成比例催产素、促肾上腺皮质激素的测定：适用127、微量生物测定法细胞培养生物测定法：

（bioassaybyinvitrocellculture）体外培养待测激素的靶细胞

测定激素作用后靶细胞的分泌物含量间接计算激素的生物活性13可用细胞测定法满足条件：

1．靶细胞分泌可测定的物质

如卵泡抑制素、GnRH2．测定分泌物的方法：

灵敏度高、操作简便

快速（ELISA、RIA）3．激素作用的靶细胞：易分离

分离培养后具有分泌功能14二、免疫测定法（immunoassay）

免疫测定法：先标记

同位素（放射性、非放射性、生物酶、荧光素）

标记抗原（半抗原）或抗体检测活性：免疫反应产物中

结合的（抗原或半抗原-抗体结合物）

或游离的标记物的活性间接计算待测激素含量15（一）种类放射免疫测定（radio-immunoassay，RIA）酶免疫测定（enzymeimmunoassay，EIA）荧光免疫测定

（fluorescenceimmunoassay，FIA）化学发光测定（chemiluminesceneimmunoassay，CLIA）16（二）基本原理与工作条件免疫反应系统tAg+Ag*+Ab

tAg-Ab

+tAg

+Ag*-Ab

+Ag*

17分离系统方法：离心、洗涤材料：二抗、活性炭、固相载体等检测系统：

酶、荧光、同位素、化学发光物质等18表2-14几种免疫测定方法的工作原理与优缺点比较

RIAEIAFIACL标记物制备放射性同位素酶酶酶结合物与游离物分离炭或二抗固相化或二抗同左同左标记物识读射线计数测吸光值测荧光值化学发光强度灵敏度(g/ml)10-9~10-1210-9~10-1310-9~10-1510-10~10-17重复性好较好较好一般准确性高高较高较高测定所需时间/h24~1441.5~241.5~241.5~24操作自动化程度半自动化完全自动化完全自动化完全自动化试剂保存时间2个月~数年数年数年数年操作防护放射防护不需要不需要不需要操作与应用特殊实验室生产场地常规实验室常规实验室对仪器设备要求高低较低较高环境潜在污染放射性同位素无无无方法种类少多较少较少19三、受体测定法原理：

激素与靶细胞上受体特异性结合亲和力高

用激素的受体代替免疫测定中的抗体从而对激素进行测定20优点：

与免疫测定法相比

用受体测定法的结果更接近于生物测定

因为激素只有与其受体结合后

才能表现其生物学活性21方法种类

受体测定法：用激素的受体代替抗体放射受体分析法

（radioreceptor-assay，RRA）

酶标受体测定法

（enzyme-labeledreceptor-assay，ERA）

荧光标记受体测定法

（fluorescence-labeledreceptorassay，FRA）22四、理化测定方法分光光度法测定激素含量：20世纪50年代前

灵敏度较低、只能检出mg/ml水平色谱法（chromatogram）、

电泳法（electrophoresis）所取代23（一）色谱法，又称层析法色谱法分类：根据分离原理：

吸附、分配、离子交换、排阻色谱法等根据分离方法：

纸色、薄层、柱色、气相、高效液相色谱法这些方法用于激素定量测定也可提取与纯化24高效液相色谱

highpresionliquidchromatogram，HPLC

高压缩液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱经进样阀注入待测物，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后依次进入检测器，记录仪或积分仪记录色谱信号25气相色谱

气体为流动相（称载气）色谱柱：填充柱、毛细管柱两种填充柱内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体注入进样口的待测物被加热气化，并被载气带入色谱柱，各成分被分离后先后进入检测器，色谱信号用记录仪或数据处理器记录26吸附色谱法被分离物质在吸附剂上被吸附能力的差异，用溶剂或气体洗脱使组分得到分离的方法常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质27分配色谱被分离物质在两相中分配系数的不同使组分得到分离固相通常涂布或键合在固定载体上，液相为气体或液体，称为流动相常用的固相载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂和纤维素粉等28离子交换色谱被分离物在离子交换树脂上交换能力不同，可使组分得到分离常用的离子交换树脂有不同强度的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液29分子排阻色谱凝胶色谱，被分离物质分子大小的差异导致填料上渗透程度不同常用填料：分子筛、葡聚糖凝胶、微孔硅胶或玻璃珠等根据固定相和待测物的性质选用水或有机溶剂作为流动相30纸色谱法

以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开待测物经展开后，可用比移值（Rf）表示各组成成分的位置影响Rf值的因素很多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同31薄层色谱将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀挨薄层待点样、展开后，与适宜对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行激素制品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法32柱色谱用内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管作为色谱管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果33（二）电泳法在电场作用下，将激素（蛋白、肽类等）在电泳介质中分离开测定电泳区带图谱或计算其含量34思考题（六）

1、简要说明生物测定的种类、基本原理、注意事项。2、激素免疫测定的方法有哪些？简要说明其基本原理和操作注意事项。3、受体测定有何意义？4、生物学测定、免疫学测定、受体测定和其他理化学测定各有何差异？35避孕节育

Contraception

激素利用36激素避孕宫内节育器自然避孕法免疫避孕促黄体素释放激素类似物避孕紧急避孕37一、激素避孕药一）激素避孕机制激素避孕药的作用：多环节、多方面药物种类、剂量、剂型、途径、方法38

1．抑制排卵干扰下丘脑-垂体-卵巢轴的功能避孕药物－－抑制下丘脑释放LHRH－－垂体分泌FSH、LH减少－－同时直接影响垂体对LHRH的反应－－不出现排卵前LH高峰－－不发生排卵392．生殖器官的作用（1）改变宫颈粘液性状

避孕药中的孕激素－－使宫颈粘液量变少、高度粘稠－－不利于精子穿透40（2）改变子宫内膜的形态、功能

着床关键：胚胎发育、子宫内膜生理同步1）避孕药的孕激素－－干扰雌激素效应－－子宫内膜增殖变化受抑制－－内膜腺体停留在发育不完全阶段－－不适于受精卵着床41

2）人工合成雌激素：大剂量：内膜生长过快，与受精卵不同步小剂量：抑制内源ES，而自身不足抑制内膜生长42（3）改变输卵管的功能

持续的雌、孕激素－－改变输卵管正常的分泌活动、蠕动－－改变受精卵在其中正常运行速度－－从而干扰受精的着床43二）激素避孕药种类激素避孕药分为四类口服避孕药注射避孕针缓释系统避孕药透皮贴剂避孕药44（一）口服避孕药

oralcontraceptive,OC长效、短效口服避孕药、探亲避孕药含雌、孕激素的复方制剂生育年龄健康妇女均可服用45（二）长效避孕针长期避孕方法之一主要含有经酯化的孕激素经肌内注射后局部沉积储存缓慢释放发挥长效作用，有效率达98%单纯孕激素类雌、孕激素复合制剂类46（三）缓释系统避孕药1．皮下埋植剂一种缓释系统的避孕剂第一代产品称NorplantI：6个硅胶囊每个含左炔诺孕酮（LNG）36mg，总量216mg第二代称NorplantⅡ：2根硅胶棒每根含LNG70mg，总量140mg472．缓释阴道避孕环

contraceptivevaginalring,CVR原理与皮下埋植相同将避孕甾体激素装在载体上制成环状放入阴道利用阴道粘膜上皮直接吸收药物进入血循环产生避孕效果48孕激素功能：1）干扰雌激素效应－－子宫内膜增殖变化受抑制－－内膜腺体停留在发育不完全阶段－－子宫内膜变化不利于受精卵着床2）促使子宫肌安静，脱落率降低3）副反应小：腹痛、月经不会过多

49三、自然避孕法推迟、提前排卵：生活、情绪、性活动、健康、外界环境等因素影响安全期避孕法：不十分可靠失败率可达20%50自然避孕法（naturalfamilyplanning,NFP）又称安全期避孕法不用任何药物、工具或手术方法顺应自然的生理规律利用月经周期中产生的自然信号识别“易受孕期”、“不易受孕期”达到避孕的目的51日历表法哺乳期闭经避孕法基础体温测量法宫颈粘液检查法52卵子自卵巢排出后可存活1~2日受精能力最强时间：排卵后24小时内精子进入女性生殖道：存活3~5日易孕期：排卵前后4~5日内安全期：其余的时间不易受孕53确定排卵日期：下次月经前14日基础体温、宫颈粘液检查多数妇女月经周期为28~30日54（1）正常月经周期1－14：卵泡期15－28：黄体期1－7 8－14 15－21 22－281月经 15排卵 26黄体退化1月经（2）受精－－妊娠1－7 8－14 15－21 22－281月经受精持续黄体1无月经约12天妊娠诊断－HCG

55四、免疫避孕免疫避孕：机体自身的免疫防御机制来阻抑妊娠尚处在研究阶段尚未用于临床、前途广泛56五、促黄体素释放激素类似物避孕正处在研究之中大剂量外源LHRH类似物抑制垂体分泌阻碍了卵泡发育、排卵57六、输卵管结扎手术

隔绝卵子运输阻止精子、卵子结合输卵管融合可恢复生育58七、紧急避孕紧急避孕（postcoitalcontraception）：无保护性生活或避孕失败或特殊情况性效（被强奸