DNS法测定还原糖的含量课件

DNS法测定还原糖的含量

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3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范实验围内反应的还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可测定生成化合物的吸光度，由标准曲线反推出还原糖的浓度。操作简便，快速，杂质干扰较少，适于生物制氢中还原糖含量的测定。实验原理Chemistry

显色条件包括:波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。此次实验选择波长选择，显色剂用量，显色时间，溶液酸度进行实验。试管号01234DNS/ml02221水/ml31糖/ml001（10-3mol/l）

1（10-4mol/l）2（10-2mol/l)二.显色条件的选择

1.波长选择取5支试管按下表加相应溶液，沸水浴15min,均加入7ml水定容为10ml，流水冷却，在不同波长处分别进行扫描。图1为不同条件下溶液的波长——吸光度图（水调零）。由图1可以看出白色与绿色曲线几乎重合，说明0.0001mol/l葡萄糖溶液与DNS反应生成的氨基化合物极少，用比色法很难区分，故此法所能够测量的葡萄糖浓度应大于0.0001mol/l。由DNS＋H2O曲线可以看出当波长大于530nm时，DNS的吸光度已经很小，这时DNS对反应生成的氨基化合物吸光度的影响可以忽略。

Fig.24号试管稀释10倍后波长扫描吸光度A

λ/nm图2为4号试管稀释10倍后波长扫描图4号试管用高浓度的葡萄糖溶液和少量的DNS试剂反应，使生成大量的氨基化合物，但其吸光度太大，仪器无法测定，故将其稀释10倍。以水调零未出现最高峰，以DNS调零时（图2）在540nm处有最高峰，这说明在该浓度下，DNS可能会对氨基化合物吸光度的测量有较大影响，故测量时以DNS调零较准确。选择540nm作为最佳吸收波长。2.DNS用量选择取试管按下表加相应溶液，沸水浴30min,加入适量水使定容为10ml，流水冷却，以1号试管中DNS溶液为参比，在540nm处测吸光度。

试管号01234567DNS/ml0211.522.533.5水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111

3.反应时间(水浴时间)取试管按下表加相应溶液，沸水浴相应时间后,加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以6号试管中的DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。

试管号0123456789DNS/ml0222222222水/ml3

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11*10-4mol/l糖/ml0111110111煮沸时间/min15510152025153040504反应溶液的酸度范围的选择取试管按下表加相应试剂，由于所用器皿为试管，不方便用PH计调节PH，此次实验采用加入不同量的6%的盐酸溶液的办法，以PH试纸调节溶液的酸度。煮沸20min后，各加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。试管号01234567DNS/ml02222222水/ml31

11*10-4mol/l葡萄糖00111111PH/〉141189107〉14三．标准曲线的建立取试管按下表加相应试剂，由0.01mol/l葡萄糖标准液配制x*10-4mol/l（3<=x<=27）的葡萄糖，煮沸30min后，各加入7ml水定容为10ml，流水冷却，以DNS试剂调零，在540nm处测吸光度。试管号01234567891011121314DNS/ml022222222222222水/ml31

葡萄糖/ml001111111111111浓度/10-4mol/l

3579111315171921232527下图1为葡萄糖标准曲线图，葡萄糖含量（mol/l）与相应的吸光度（A）有一定的线性关系，且其回归方程为：y=-0.14971+0.035786x，R=0.9954。另外采用较高浓度的葡萄糖来制作标准曲线，得到下图2：其回归方程为：y=-0.10483+0.031804x,R=0.99817.当所测得的吸光度比较小时，可用图