过氧化氢酶米氏常数的测定

过氧化氢酶米氏常数的测定过氧化氢酶米氏常数的测定生物化学实验【目的】【目的】过氧化氢酶米氏常数的测定掌握米氏方程及其意义。掌握过氧化氢酶米氏常数测定的原理、方法和步骤。【原理】

1.米氏方程【原理】米氏方程：当环境温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应速度v

与底物浓度[S]的关系符合米氏方程。v

=────Vmax[S]Km

+[S]Vmax：最大反应速度Km：米氏常数02468101214161820020406080底物浓度

[S]Vm2Km初速率

vVm动力学曲线Km值：可通过对米氏方程作图(V~[S]图)求出。在数值上等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度值。单位是mol/L(或mmol/L)。当v

=──

时，Km

=

[S]Vm2以不同的底物浓度[S]为横坐标，[S]/v为纵坐标，将各点连成一直线，并向纵轴方向延长，此延长线在横轴上的截距即为–Km值。2.汉斯方程2.汉斯方程

v

=────Vmax[S]Km

+[S]在实际应用中，通过动力学曲线求Km值，即使用很大的[S]，也只能得到趋近于Vm的反应速度，难以达到真正的Vmax，因此测不到准确的Km值。为得到准确的Km值，可以把米氏方程转化为

y

=

ax

+

b

的直线方程，然后用图解法求出Km值。本实验采用汉斯作图法(HanesPlot)求Km值。将米氏方程两边取倒数再乘以[S]即为汉斯方程：(汉斯方程式)──=──

.[S]+──1Vm[S]vKmVm方程式两边取倒数再乘以[S]汉斯方程作图──[S]v1斜率=

──Vm0[S]Km──Vm–Km3.鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理本实验以鼠肝匀浆中的过氧化氢酶为例，测定其Km值和Vm值。2H2O22H2O+O2过氧化氢酶2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2↑+8H2O过氧化氢酶催化H2O2分解成H2O和O2；反应后剩余的H2O2用KMnO4在酸性溶液中滴定；通过滴定KMnO4的消耗量求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度v；通过汉斯作图法可求出过氧化氢酶的Km值和Vm值。说明：KMnO4既是氧化剂，又是指示剂；Mn2+是滴定反应的催化剂。3.鼠肝过氧化氢酶测定化学反应原理

操作

1.肝匀浆制备【操作】1.肝匀浆制备将小白鼠处死，立即取出肝脏，去除胆囊及结缔组织，用0.45％的盐水洗净。称取1g肝组织加1ml0.45%盐水放入匀浆器，研磨成匀浆。取上述匀浆，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释至1:10。取1:10的匀浆液1ml，用pH7.0的磷酸缓冲液稀释定容至50ml(1:500)。2.反应速度测定2.反应速度测定说明：①

试剂加量要准确；每个三角瓶可分别保温，但要准确计时。10％H2SO4液可事先准备好，到时直接倾入。KMnO4用量记录精确度：0.0113.389.966.773.841.433.计算

①计算各管底物浓度3.计算①按下式计算各管底物浓度(mmol/L)填入下表H2O2浓度(mmol/L)×

加入H2O2的体积(ml)26ml(反应液总体积)[S](mmol/L)=38.46230.76920.37715.3857.692②计算各管反应速度3.计算②按下式计算各管反应速度(mmol/10min)填入下表0.3310.3020.2620.2080.129

(mmol/L)=H2O2浓度(mmol/L)×

加入H2O2的体积(L)

–KMnO4(mmol/L)×消耗的KMnO4的体积(L)×5/2③计算各管[S]/v3.计算③计算各管[S]/v值(10min/L)填入下表116.198101.88588.24873.96459.862④汉斯作图3.计算④汉斯方程作图求Km值和Vm值[S]v—–=—–+—–

KmVm1Vm[S]汉斯方程：汉氏作图–30–25–20–15–10–5

051015

2025303540[S](mmol/L)[S]/v

(10min/L)12010080604020–Km=–25y=1.8277x

+45.854—–

=46

KmVm以[S]为横坐标，[S]/v

为纵坐标，制作[S]/v

~[S]坐标图。将测定各点连成一直线，并向纵轴方向延长与横轴相交，交点为横截距，即–Km

。纵截距为Km/

Vm

。从坐标图查得–Km=–25，即：Km=25mmol/L

。从坐标图查得Km/Vm

=46，将Km值代入求得：Vm=0.543mmol/10min

。*Excel汉斯作图Excel汉氏作图-35-30-25

-20-15

-10

-50510

1520253035404520406080100120140[S](mmol/L)[S]/v

(10min/L)–Km=–25y

=1.8277x+45.854—–

=46

KmVmKm=25mmol/LVm=0.543mmol/10min*Excel双倒数作图

y

=45.786x+1.8311Excel双倒数作图-0.1-0.0500.050.10.150.21234567891/[S](L/mmol)(0,1/Vm＝1.83)(–1/Km＝–0.04,0)1/v(10min/mmol)Km=25mmol/LVm=0.546mmol/10min*Excel-Eadie-Hofstee作图

y

=-25.051x+0.54670.10.20.30.40.50.6-0.00500.0050.010.0150.020.025v/[S](L/10min)v(mmol/10min)0.5450.0218Km=25mmol/LVm=0.545mmol/10minExcel-Eadie-Hofstee作图*Excel直线作图Excel直线作图直接从坐标点读出：Km=25