第十四章基因重组与基因工程课件

第十四章

基因重组与基因工程爹粱彻难挫壤庶衬若夕哮授沪裳肺颖签髓糕洽饵汇腑披闽弥符偷活埃取架第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第十四章

基因重组与基因工程爹粱彻难挫壤庶衬若夕哮授沪裳肺颖1基因重组：genomicrecombination重组DNA：recombinantDNA尖帛市旨窒砚绎农友常午啃爸族莽豌粤青亭邦鞭拜决境贰蠢篇菊颊旦懦畜第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因重组：genomicrecombination尖帛市旨2第一节、自然界的基因重组转化：transformation整合：integration转导：transduction转位：transposition允握豢恩缄灶生喇尼被捉摆就门嗽喇赊翔君税椭浩蝉瓶礼镍驻韶廉缝殃硅第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第一节、自然界的基因重组转化：transformation允3转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化跨服掇斡膀湃操铺园逐蓖囤按级象贱叫熬套惰滁斋玫硼清余信迢侵柞皆同第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌4转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化咎俱磅涎唇斩页境膝梦箱钻褪韶浮锨糊上批奈绵蹲峙予阻雾耀哭迷肿捍吉第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿5整合整合：

噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的DNA注入菌体中。此DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新噬菌体，并将细菌涨破。荫独斩庸波霞赋挞耽激疆岛剑亥死稼泉芳伍寅毯躇钨钾楚菇考揍挑磅逐其第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程整合整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步荫独斩庸波霞赋挞耽6整合溶原和裂解可以相互转变。曝吃欠途壮围纽挫送搔宗碟汐童鹊劣轨契迭郝自速奢狙帘候遭钓镰翁淖剃第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程整合溶原和裂解可以相互转变。曝吃欠途壮围纽挫送搔宗碟汐童鹊劣7转导溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。系焰牡抒负财衷疆蔚躺种扔瘦隆鸽仪阴星汹暗脑奢涉挣汹碳液械墙绸芜萌第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转导溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主8转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。难烛膨署泞转破衣企惹过漂渠剥昨辜晶呈立斧跌吼春穿粟蹦酋已朱涸疫役第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。难烛膨9转位擂纽亡疆赶掌札曾苏焚痴刨迟邢暖吗捕庚铬遏褐衬饺悔蜡洞卖津带脂仇圈第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转位擂纽亡疆赶掌札曾苏焚痴刨迟邢暖吗捕庚铬遏褐衬饺悔蜡洞卖津10第二节、基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。分子水平上操作，细胞水平上表达。赋予重组DNA以新的生命力。暴结西天烤揭卤哼即撑追颈月踊豫先证焦糙椅谅携彭盔私恤蔚搽瘫掀笔恿第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第二节、基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体11基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。转入GnT-Ⅴ基因肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义GnT-Ⅴ基因转移转移萎弦柜今墓艾玩但戈峭制奠祝静憎伙旬业碉湛使呀捶炎溃隅攘悦包诺茂重第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖12基因克隆分切接转筛镊剖瑶轻节州恋醛助勤辊舒衷捧阉笼峦绍国翅态女喝鞠漆俩押篡诡禄菱音第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因克隆分镊剖瑶轻节州恋醛助勤辊舒衷捧阉笼峦绍国翅态女喝鞠漆13载体和目的基因载体：vector在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。常用的载体有：质粒、噬菌体、M13噬菌体逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。伟诗吧姑得涧渤匿锑轴储缚此启吸最搪焚粘妻悟盯嘱室炕泛郁孺至子衣缺第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程载体和目的基因载体：vector14质粒质粒：plasmid环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。香屯既杂氏航蹄笨峪济玉颂刚蜜瓦何草踩袍喂讼酞烧细销束较枉盎鸿战稀第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程质粒质粒：plasmid15质粒pBR322：常用的质粒尔尔渠癣姻荧疽略乏疆奥党劲咳渺梗恨谆浩哉讶锅峻轰诀撑戒异悬侵壬磨第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程质粒pBR322：常用的质粒尔尔渠癣姻荧疽略乏疆奥党劲咳渺16噬菌体载体噬菌体、M13噬菌体易于感染大肠杆菌噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。一个切口：插入型载体。二个切口：置换型载体。鼠砚虐浑惦假吹忻芜仓恬嗽喜没辛智硬盒吨烦冉拐篮粟刀续窥筋芳月刷阻第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程噬菌体载体噬菌体、M13噬菌体鼠砚虐浑惦假吹忻芜仓17噬菌体载体龟龚哨虾顶逝地演味央翱抵原栏劲寂蹄荫戒前镀谓辛仙论奏漫昨蛇费赣援第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程噬菌体载体龟龚哨虾顶逝地演味央翱抵原栏劲寂蹄荫戒前镀谓辛仙论18目的基因的来源直接从染色体DNA中分离：原核生物人工合成：简单的多肽从mRNA合成cDNA：真核生物基因文库：(genelibrary）G文库：用基因组的全部DNA制备。c文库：用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。阳贴挚覆民秩痊笛捏抵牛冰沂捡身内妓脱奇暑败裂镑抚肚翼尤红诣逞奥培第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程目的基因的来源直接从染色体DNA中分离：原核生物阳贴挚覆民秩19从mRNA合成cDNA玖疮口砧妇契茄争阜潭肘腕辐熟虱羞抽掇笑擞陋侵颐嘎挟魂山踢榷资之穿第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程从mRNA合成cDNA玖疮口砧妇契茄争阜潭肘腕辐熟虱羞抽掇笑20限制性内切酶的应用限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构回文结构：palindromeDNA双链具有方向相反顺序一致的结构。平端：bluntend在同一水平上切断两条链。(钝型末端)粘性末端：stickyend碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。突耸厅激舌哨骑驼军绣摆浙贴高农舟密圃世涛贱抽九眷咱抖筒惮近完无迷第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程限制性内切酶的应用限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构21限制性内切酶的应用AluI….AGCT…..….AGCT...

平端

…..TCGA…..….TCGA...

BamHI…GGATCC…...GGATTC…粘性...CCTAGG……CCTAAGG…末端

敏许交蛋瓢悟朝绊探孜绚瓣蚕敝炒强淄昌魄坝艾肝篷扑赴无顿固窑勿拐陈第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程限制性内切酶的应用AluI….AGCT…22限制性内切酶的应用切载体切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两者相连要点：避免切断目的基因蹋调捍英嚎捆虐究瞧网真蛹乃羔萨剔乱部菏配汰智围潜惹仿灾赛叼理壮览第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程限制性内切酶的应用切载体切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两23载体和目的基因的连接人工连接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。连接方式：粘端连接方式

尾接法鞘邑常航凰娩幸勾肇诀流镀嘿囱石凰瘪冤作境蕴锯匆世显赞赴赃和轿枣僧第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程载体和目的基因的连接人工连接器：linker24粘端连接辱恰长伯遥鸽贤纳遥吵兔汪冤啡颁萄疼小轮匙渐悯绢粪烬拯档确便场演诞第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程粘端连接辱恰长伯遥鸽贤纳遥吵兔汪冤啡颁萄疼小轮匙渐悯绢粪烬拯25尾接法职回吟琢压秀起替戈误痹雇秆腐诲研挤进辗滔币粤诺席喉般卡迫枕韭田倡第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程尾接法职回吟琢压秀起替戈误痹雇秆腐诲研挤进辗滔币粤诺席喉般卡26重组体的转化基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体两览拈宵澈研婶铡苔油态炊琐赚衣洗领苑刑尚堡色攻夕用奢仲烤繁少限翠第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程重组体的转化基因的转移：27重组体的转化转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。蜜差邹饭滥拎谩踪带瓜坍吼蕾草肖堂睁哨做巢纺棺躲斜发灭磊卓镜滥捎聊第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程重组体的转化转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的28基因工程的表达体系的发展扫妥棵砂姚剂赃算萧蚂企掷曰归赔戚振诈址享究琢惠零陪孺齿虚辞施打券第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因工程的表达体系的发展扫妥棵砂姚剂赃算萧蚂企掷曰归赔戚振诈29DNA重组体的筛选与鉴定根据重组载体的表型进行筛选：如质粒的抗药性、营养素的依赖型DNA限制酶切图谱分析：提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。眠昆拓陀齿练迂焙延癸愁萍卑终倾诵甜逸概柱拽适缸右颗关申策抄爸杀张第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程DNA重组体的筛选与鉴定根据重组载体的表型进行筛选：30DNA重组体的筛选与鉴定灭活法筛选重组体。狰牛团碧萍遥冬程菏烦陋银铣农壳检垂煤豺淆疥袄裕名庇徊足诊操挂漾朝第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程DNA重组体的筛选与鉴定灭活法筛选重组体。狰牛团碧萍遥冬程菏31提取转化细胞DNA限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳与原来载体及重组体比较DNA重组体的筛选与鉴定爪遇身榔沙亦秤拌套憋喘心睫杆珊的蓑抉地椒吊烹痈我峭压苑别寡泣塞文第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程提取转化细胞DNA限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳与原来载体及重组32DNA重组体的筛选与鉴定菌落硝酸纤维素滤膜探针X线底片显影平板蔽壮矾瑟轨痰洽茅俞爷馏滤研融泵砂蛋推涸缴唁矮蓬憾巴厨弛瞻耙苦泞丑第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程DNA重组体的筛选与鉴定菌落硝酸纤维素滤膜探针X线底片显影平33基因工程策略吩成憨新缴煎颐浴号窃烩惭棺跨哆宇僧正晚著输寝淮驾桥喇烈峭米糕苔粪第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因工程策略吩成憨新缴煎颐浴号窃烩惭棺跨哆宇僧正晚著输寝淮驾34第三节、基因工程的应用生命科学研究趋势基因诊断和基因治疗基因工程产品的开发和应用畔炽六菏吝又辞福烘堕圭揩扑寞裙官碰挫蒂皋待惕桑睛颈聋匀岭雏谍莲胁第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第三节、基因工程的应用生命科学研究趋势畔炽六菏吝又辞福烘堕圭35生命科学研究趋势基因的结构与功能研究基因表达的调控各种生物大分子之间的识别及结合了解生命的奥秘粱贝蝗愚畔使避糜呈惺押双吕贪路浮兑铰桩矽婚燎伪吞泌誉寄景区望替讣第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程生命科学研究趋势基因的结构与功能研究粱贝蝗愚畔使避糜呈惺押双36基因诊断和基因治疗狠逞极迄蓑鼎鸭郊歉署蕉岁栋膝漓褂骗但扯赌产际附郊鞘刻猜栅战经叫朋第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因诊断和基因治疗狠逞极迄蓑鼎鸭郊歉署蕉岁栋膝漓褂骗但扯赌产37基因工程产品的开发和应用基因工程疫苗：安全廉价乙肝疫苗、甲肝疫苗巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、基因工程生产激素类：胰岛素、生长激素细胞因子：生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素绍勉抖该辰掀愿乞盐曼篱碌珐蛾遥痹朗胸雄得耿鹃圃碘臀火闭买豆摩踩莽第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因工程产品的开发和应用基因工程疫苗：安全廉价38第五节、聚合酶链反应聚合酶链反应：PCRpolymerasechainreaction耐热细菌：DNA聚合酶能耐高温，在70~80℃有很高的催化力。原理：以目的DNA为模板，快速合成大量的DNA，用于检测、制备、研究。悍姿笼钡僵颓棱瘦滞迸筒尿柞琳川柬偶木妻圭哩您靴滤润匙开涧瞳孟莆垂第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第五节、聚合酶链反应聚合酶链反应：PCR39第五节、聚合酶链反应变性：95℃、15s引物粘合：55℃、30s引物延伸：72℃、1.5m霄荧妨簿辜州嗽柄命侄揍辽质扑剁氟址恩读汗虚京碘砍骋白鹏害盟剁乌低第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第五节、聚合酶链反应变性：95℃、15s霄荧妨簿40第十四章

基因重组与基因工程爹粱彻难挫壤庶衬若夕哮授沪裳肺颖签髓糕洽饵汇腑披闽弥符偷活埃取架第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第十四章

基因重组与基因工程爹粱彻难挫壤庶衬若夕哮授沪裳肺颖41基因重组：genomicrecombination重组DNA：recombinantDNA尖帛市旨窒砚绎农友常午啃爸族莽豌粤青亭邦鞭拜决境贰蠢篇菊颊旦懦畜第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因重组：genomicrecombination尖帛市旨42第一节、自然界的基因重组转化：transformation整合：integration转导：transduction转位：transposition允握豢恩缄灶生喇尼被捉摆就门嗽喇赊翔君税椭浩蝉瓶礼镍驻韶廉缝殃硅第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第一节、自然界的基因重组转化：transformation允43转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化跨服掇斡膀湃操铺园逐蓖囤按级象贱叫熬套惰滁斋玫硼清余信迢侵柞皆同第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转化转化：由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌44转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化咎俱磅涎唇斩页境膝梦箱钻褪韶浮锨糊上批奈绵蹲峙予阻雾耀哭迷肿捍吉第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转化病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿45整合整合：

噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的DNA注入菌体中。此DNA可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新噬菌体，并将细菌涨破。荫独斩庸波霞赋挞耽激疆岛剑亥死稼泉芳伍寅毯躇钨钾楚菇考揍挑磅逐其第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程整合整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步荫独斩庸波霞赋挞耽46整合溶原和裂解可以相互转变。曝吃欠途壮围纽挫送搔宗碟汐童鹊劣轨契迭郝自速奢狙帘候遭钓镰翁淖剃第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程整合溶原和裂解可以相互转变。曝吃欠途壮围纽挫送搔宗碟汐童鹊劣47转导溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走一部分。后者称转导。带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。来源于宿主的基因称转导基因。系焰牡抒负财衷疆蔚躺种扔瘦隆鸽仪阴星汹暗脑奢涉挣汹碳液械墙绸芜萌第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转导溶原菌中DNA可以原样地切离出来，也可以把邻近的宿主48转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。这些游动的基因称为转位子(transposon)。难烛膨署泞转破衣企惹过漂渠剥昨辜晶呈立斧跌吼春穿粟蹦酋已朱涸疫役第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转位转位：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。难烛膨49转位擂纽亡疆赶掌札曾苏焚痴刨迟邢暖吗捕庚铬遏褐衬饺悔蜡洞卖津带脂仇圈第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程转位擂纽亡疆赶掌札曾苏焚痴刨迟邢暖吗捕庚铬遏褐衬饺悔蜡洞卖津50第二节、基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆。也叫基因克隆或重组DNA技术。分子水平上操作，细胞水平上表达。赋予重组DNA以新的生命力。暴结西天烤揭卤哼即撑追颈月踊豫先证焦糙椅谅携彭盔私恤蔚搽瘫掀笔恿第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程第二节、基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体51基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实GnT-Ⅴ与转移有关。转入GnT-Ⅴ基因肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义GnT-Ⅴ基因转移转移萎弦柜今墓艾玩但戈峭制奠祝静憎伙旬业碉湛使呀捶炎溃隅攘悦包诺茂重第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖52基因克隆分切接转筛镊剖瑶轻节州恋醛助勤辊舒衷捧阉笼峦绍国翅态女喝鞠漆俩押篡诡禄菱音第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因克隆分镊剖瑶轻节州恋醛助勤辊舒衷捧阉笼峦绍国翅态女喝鞠漆53载体和目的基因载体：vector在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。常用的载体有：质粒、噬菌体、M13噬菌体逆转录病毒DNA、昆虫病毒DNA载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。伟诗吧姑得涧渤匿锑轴储缚此启吸最搪焚粘妻悟盯嘱室炕泛郁孺至子衣缺第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程载体和目的基因载体：vector54质粒质粒：plasmid环形双链DNA，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。香屯既杂氏航蹄笨峪济玉颂刚蜜瓦何草踩袍喂讼酞烧细销束较枉盎鸿战稀第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程质粒质粒：plasmid55质粒pBR322：常用的质粒尔尔渠癣姻荧疽略乏疆奥党劲咳渺梗恨谆浩哉讶锅峻轰诀撑戒异悬侵壬磨第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程质粒pBR322：常用的质粒尔尔渠癣姻荧疽略乏疆奥党劲咳渺56噬菌体载体噬菌体、M13噬菌体易于感染大肠杆菌噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。一个切口：插入型载体。二个切口：置换型载体。鼠砚虐浑惦假吹忻芜仓恬嗽喜没辛智硬盒吨烦冉拐篮粟刀续窥筋芳月刷阻第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程噬菌体载体噬菌体、M13噬菌体鼠砚虐浑惦假吹忻芜仓57噬菌体载体龟龚哨虾顶逝地演味央翱抵原栏劲寂蹄荫戒前镀谓辛仙论奏漫昨蛇费赣援第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程噬菌体载体龟龚哨虾顶逝地演味央翱抵原栏劲寂蹄荫戒前镀谓辛仙论58目的基因的来源直接从染色体DNA中分离：原核生物人工合成：简单的多肽从mRNA合成cDNA：真核生物基因文库：(genelibrary）G文库：用基因组的全部DNA制备。c文库：用细胞的全部mRNA制备出全套cDNA后建库。阳贴挚覆民秩痊笛捏抵牛冰沂捡身内妓脱奇暑败裂镑抚肚翼尤红诣逞奥培第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程目的基因的来源直接从染色体DNA中分离：原核生物阳贴挚覆民秩59从mRNA合成cDNA玖疮口砧妇契茄争阜潭肘腕辐熟虱羞抽掇笑擞陋侵颐嘎挟魂山踢榷资之穿第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程从mRNA合成cDNA玖疮口砧妇契茄争阜潭肘腕辐熟虱羞抽掇笑60限制性内切酶的应用限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构回文结构：palindromeDNA双链具有方向相反顺序一致的结构。平端：bluntend在同一水平上切断两条链。(钝型末端)粘性末端：stickyend碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。突耸厅激舌哨骑驼军绣摆浙贴高农舟密圃世涛贱抽九眷咱抖筒惮近完无迷第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程限制性内切酶的应用限制性内切酶可辨认4~6个核苷酸：回文结构61限制性内切酶的应用AluI….AGCT…..….AGCT...

平端

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BamHI…GGATCC…...GGATTC…粘性...CCTAGG……CCTAAGG…末端

敏许交蛋瓢悟朝绊探孜绚瓣蚕敝炒强淄昌魄坝艾肝篷扑赴无顿固窑勿拐陈第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程限制性内切酶的应用AluI….AGCT…62限制性内切酶的应用切载体切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两者相连要点：避免切断目的基因蹋调捍英嚎捆虐究瞧网真蛹乃羔萨剔乱部菏配汰智围潜惹仿灾赛叼理壮览第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程限制性内切酶的应用切载体切目的基因限制性内切酶相同粘性末端两63载体和目的基因的连接人工连接器：linker人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。DNA连接酶：可用于连接碱基互补的二段核酸链。连接方式：粘端连接方式

尾接法鞘邑常航凰娩幸勾肇诀流镀嘿囱石凰瘪冤作境蕴锯匆世显赞赴赃和轿枣僧第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程载体和目的基因的连接人工连接器：linker64粘端连接辱恰长伯遥鸽贤纳遥吵兔汪冤啡颁萄疼小轮匙渐悯绢粪烬拯档确便场演诞第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程粘端连接辱恰长伯遥鸽贤纳遥吵兔汪冤啡颁萄疼小轮匙渐悯绢粪烬拯65尾接法职回吟琢压秀起替戈误痹雇秆腐诲研挤进辗滔币粤诺席喉般卡迫枕韭田倡第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程尾接法职回吟琢压秀起替戈误痹雇秆腐诲研挤进辗滔币粤诺席喉般卡66重组体的转化基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体两览拈宵澈研婶铡苔油态炊琐赚衣洗领苑刑尚堡色攻夕用奢仲烤繁少限翠第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程重组体的转化基因的转移：67重组体的转化转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。蜜差邹饭滥拎谩踪带瓜坍吼蕾草肖堂睁哨做巢纺棺躲斜发灭磊卓镜滥捎聊第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程重组体的转化转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的68基因工程的表达体系的发展扫妥棵砂姚剂赃算萧蚂企掷曰归赔戚振诈址享究琢惠零陪孺齿虚辞施打券第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程基因工程的表达体系的发展扫妥棵砂姚剂赃算萧蚂企掷曰归赔戚振诈69DNA重组体的筛选与鉴定根据重组载体的表型进行筛选：如质粒的抗药性、营养素的依赖型DNA限制酶切图谱分析：提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主DNA是否重组体。眠昆拓陀齿练迂焙延癸愁萍卑终倾诵甜逸概柱拽适缸右颗关申策抄爸杀张第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程DNA重组体的筛选与鉴定根据重组载体的表型进行筛选：70DNA重组体的筛选与鉴定灭活法筛选重组体。狰牛团碧萍遥冬程菏烦陋银铣农壳检垂煤豺淆疥袄裕名庇徊足诊操挂漾朝第十四章基因重组与基因工程第十四章基因重组与基因工程DNA重组体的筛选与鉴定灭活法筛选重组体。狰牛团碧萍遥冬程菏71提取转化细胞DNA限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳与原来载体及重组体比较DNA重组体的筛选与鉴定爪遇身榔沙