DB11-T 507-2007-玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法-（高清有效）

DBICS65.020.20DBB21备案号：21532-2007北 京 市 地 方 标 准DB11/T507—2007玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法SSR-basedMethodtoAssayPurityandGenuinenessinZeamaysL.2007-11-22发布 2008-02-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T507—2007前言AB本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中心。郭慧杰。IDB11/T507—2007玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法范围本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1品种纯度varietalpurity品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。2.2品种真实性varietalgenuineness供检品种与标准品种的符合程度。2.3SSR分子标记simplesequencerepeatmarker由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列。2.4引物primer结合在模板DNA上的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。原理PCRSSR的纯度及真实性。仪器设备及试剂仪器设备PCR；DNA（300A（0.01g,001g；冰箱；微量加样器（05L～10L,20L～20µ,00L～100L；磁力搅拌器；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；酸度计等。（500mL1000mL5L.m0µ20µL，100L)（10L9696PCR（55cm×3cm8试剂（EDTA-Na（Hl3%(NaOH)；10CR（g2+-20℃（MgCl2（dNTPsAµL-20℃SSR-20℃；矿物油；1DB11/T507—2007（BindingSlne；剥离硅烷（Reliae；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。DNA提试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。引物筛选适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的原则。可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。常见适用于玉米品种的纯度及真实性分析的SSR引物名称及序列参见附录B。方法步骤DNA提取96150µLDNA5min150µLTEDNA样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在冰箱中冷冻长期保存。扩增96PCR13.5L2L10PCR2.5LMgCl2（25mo/12LdN(.5mo/025LSR0molL025LTqAU/L)，混匀。2LDNA1PCR：94℃预变性5min；9440s，6035s，72℃45s35；72℃5min；4℃保存。检测胶板制作0.5%亲和硅烷（BindingSilane）0.5mL，2.0%剥离硅烷（RepelSilane）0.5mL。操作过程中防止两块玻璃板互相平仪调平。4.5%PA80mL80L25%80L1h预电泳在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）1TBE600ml，拔出梳子，90W15min～20min。点样20lPCR4l6PCR95℃5min，4℃冷10min5l电泳80W恒功率电泳30min。染色电泳结束后，分开两块玻璃板。将带凝胶的玻璃板浸入固定液中轻轻晃动3min，再放入去离子水中漂洗10s，然后将胶板放入染色液中染色5min。2DB11/T507—2007将染色后的胶板放入去离子水中漂洗10s，然后在显影液中轻轻晃动直至带纹清晰。将显影后的胶板放入固定液中定影5min，再用去离子水漂洗1min。纯度检测取样从送检样品中随机取不少于100粒种子。SSR分析按照本标准第6章规定的方法步骤进行。数据计算和表示（自交系供检种子粒数非本品种种子粒数100供检种子粒数（供检种子粒数母本种子粒数其他类型种子粒数100供检种子粒数真实性鉴定取样分别从送检样品和标准样品中各随机抽取10粒种子。SSR分析40SSR6结果判定送检样品与标准样品之间未检测出差异，判定送检样品与标准样品属于同一品种。送检样品与标准样品有一对以上（包括一对）引物检测出差异，判定送检样品与标准样品不属于同一品种。送检样品或标准样品存在两种或两种以上带型，以出现次数最多的一种带型作为该样品典型带型。3DB11/T507—2007附录A（规范性附录）主要试剂配制DNA提取试剂配制10mol/LNaOH160mL200mL。0.5ml/LDTA（H8.：取EDTA-Na218.1g100mL蒸馏水，再加入适量10mol/LNaOH溶液，加热至完全溶解后，冷却至室温，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至8.0，加水定容至1000mL，高压灭菌。1mlLTsHpH0HCl)调pH至8.0，加水定容至500mL，高压灭菌。TEH20mlLTiHH8）mL0mlLET（pH.）1LDNA提取液：取NaOH2g，先用200mL蒸馏水溶解，再加水定容至500mL，高压灭菌。PCR扩增试剂配制dNTPs：用超纯水分别配制ATP、GTP、CTP、TTP终浓度为100mmol/L的储存液，各取20μL混合，加入720μL超纯水定容至终浓度2.5mmol/L。SSR引物：用超纯水分别配制左引物（L）和右引物（R）终浓度均为40μmol/L的储存液，等体积混合成20μmol/L。凝胶与电泳试剂配制6倍加样缓冲液：取去离子甲酰胺49mL，加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青FF0.125g，混匀。10倍TBE缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）108g55g，加适量去离子水溶解后，再加入0.5mol/LEDTA（pH8.0）37mL，加水定容至1000mL。40%PA190g和甲叉双丙烯酰胺400mL500mL。4.5%PA450g，10倍TBE缓冲液100mL和40%PA胶112.5亲和硅烷（BindingSilane）缓冲液：取无水乙醇49.75mL和冰醋酸250µL，混合。05%Bnigiae9.95mL5025％过硫酸铵：取0.25g过硫酸铵，加1mL去离子水溶解，现用现配。1倍TBE缓冲液：取10倍TBE500mL，加4500mL去离子水混匀。银染试剂配制固定液：取冰醋酸100mL，加去离子水定容至1000mL。染色液：取硝酸银2g，加去离子水定容至1000mL。显影液：取氢氧化钠30g和甲醛5mL，加去离子水定容至1000mL。4DB11/T507—2007附录B（资料性附录SSR表B.1 玉米品种纯度检测常用的SSR引物编号引物名称引物序列1bnlg439左引物（L）: 右引物（R）: 2bnlg161左引物（L）: 右引物（R）: 3bnlg125左引物（L）: GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3＇右引物（R）: 4bnlg198左引物（L）: 右引物（R）: 5bnlg238左引物（L）: 右引物（R）: 6bnlg240左引物（L）: 右引物（R）: 7bnlg107左引物（L）: 右引物（R）: CAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGTGAA-3＇8phi034左引物（L）: 右引物（R）: GGGGAGCACGCCTTCGTTCT-3＇9phi053左引物（L）: 右引物（R）: AACCCAACGTACTCCGGCAG-3＇10phi056左引物（L）: ACTTGCTTGCCTGCCGTTAC-3＇右引物（R）: CGCACACCACTTCCCAGAA-3＇11phi065左引物（L）: 右引物（R）: 12phi072左引物（L）: 右引物（R）: 13phi080左引物（L）: CACCCGATGCAACTTGCGTAGA-3＇右引物（R）: TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3＇14phi085左引物（L）: 右引物（R：3＇15phi96100左引物（L）: AGGAGGACCCCAACTCCTG-3＇右引物（R）: 16umc1061左引物（L）: 右引物（R）: 17bnlg233左引物（L）: 右引物（R）: GGAGCTTGCGCTTTTTAACA-3＇18umc2084左引物（L）: 右引物（R）: 19bnlg1450左引物（L）: ACAGCTCTTCTTGGCATCGT-3＇右引物（R）: GACTTTGCTGGTCAGCTGGT-3＇20bnlg1940左引物（L）: 5CCTTTTGTTTCAGGCCGTTA-3＇右引物（R）: 5DB11/T507—2007表B.2 玉米品种真实性鉴定常用的SSR引物编号引物名称引物序列1bnlg125左引物（L）: 5＇-GGGACAAAAGAAGAAGCAGAG-3＇右引物（R）: 2bnlg439左引物（L）: 右引物（R）: 3phi072左引物（L）: 右引物（R）: 4bnlg162左引物（L）: 右引物（R）: 5bnlg161左引物（L）: 右引物（R）: 6bnlg198左引物（L）: 右引物（R）: 7phi116左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-TCCCTGCCGGGACTCCTG-3＇8phi123左引物（L）: 5＇-GGAGACGAGGTGCTACTTCTTCAA-3＇右引物（R）: 9phi065左引物（L）: 5＇-AGGGACAAATACGTGGAGACACAG-3＇右引物（R）: 10umc1040左引物（L）: 5＇-CATTCACTCTCTTGCCAACTTGA-3＇右引物（R）: 11umc1944左引物（L）: 右引物（R）: 12phi077左引物（L）: 5＇-GAGAAGAGGATCAGGTTCGTTCCA-3＇右引物（R）: 13bnlg240左引物（L）: 右引物（R）: 14bnlg238左引物（L）: 右引物（R）: 15phi085左引物（L）: 5＇-AGCAGAACGGCAAGGGCTACT-3＇右引物（R）: 5＇-TTTGGCACACCACGACGA-3＇16umc1196左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-AGTCGTTCGTGTCTTCCGAAACT-3＇17bnlg1006左引物（L）: 5＇-GACCAGCGTGTTGATCCC-3＇右引物（R）: 5＇-GAGACCCCGACTCTCTCTC-3＇18bnlg1621左引物（L）: 5＇-CTCTTCGATCTTTAAGAGAGAGAGAG-3＇右引物（R）: 5＇-ACACGAGGCACTGGTACTAACG-3＇19phi295450左引物（L）: 5＇-CCTTTTCATGTTGCTTTCCC-3＇右引物（R）: 5＇-GCCCAATCCTTCCTTCCT-3＇20phi053左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-AACCCAACGTACTCCGGCAG-3＇6表B.2（续）

DB11/T507—2007编号引物名称引物序列编号引物名称引物序列21umc1904左引物（L）: 右引物（R）: 22phi048左引物（L）: 右引物（R）: 23phi080左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-TCGTCACGTTCCACGACATCAC-3＇24phi099左引物（L）: 5＇-TACAAAAATCAGGACTGCGAAAAACCCAA-3＇右引物（R）: 5＇-GTCGGTGTGTGATCCTTCCAC-3＇25phi015左引物（L）: 5＇-GCAACGTACCGTACCTTTCCGA-3＇右引物（R）: 5＇-26phi037左引物（L）: 5＇-CCCAGCTCCTGTTGTCGGCTCAGAC-3＇右引物（R）: 5＇-TCCAGATCCGCCGCACCTCACGTCA-3＇27bnlg1306左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-CAAAAACAAATGGCAGCTGA-3＇28bnlg1505左引物（L）: 5＇-GAAAGACAAGGCGAAGTTGG-3＇右引物（R）: 5＇-GCTTCTGAACTGGATCGGAG-3＇29bnlg1884左引物（L）: 右引物（R）: 30umc2105左引物（L）: 右引物（R）: 5＇-TCCCGTGACACTCTCTTTCTCTCT-3＇31phi047左引物（L）: 5＇-GGAGATGCTCGCACTGTTCTC-3＇右引物（R）: 32bnlg2291左引物（L）: 5＇-CCTCTCGATGTTCTGAAGCC-3＇右引物（R）: 33umc1822左引物（L）: 右引物（R）: 34bnlg1401左引物（L）: 5＇-CACTCGGTTTTTGCTTAGCC-3＇右引物（R）: 5＇-GTGTCGTCGAGTGCATGC-3＇35nc004左引物（