生物化学：第三章酶2

非专一性不可逆抑制剂

有机磷化合物—与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶。（DFP、敌百虫、敌敌畏、农药1605等，）

DFP的作用二异丙基氟磷酸有机汞、有机砷化合物—与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH酶的活性。（对氯汞苯甲酸）双巯基丙醇解毒作用路易斯毒气作用机制

氰化物、硫化物、CO—与含铁卟啉的酶（细胞色素氧化酶）中的Fe3+结合，使酶失活。

重金属—能使大多数酶失活，加入EDTA可以除去。

烷化剂—使酶蛋白中的–SH、-NH2、-OH等发生烷基化，失活（碘乙酸、碘乙酰胺等）。

青霉素—抗菌素类药物，与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合（与细菌的细胞壁合成有关），使酶失活。

b.可逆抑制作用(reversible

inhibition)

抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类

b1竟争性抑制(competitiveinhibition)

b2

非竟争性抑制(noncompetitiveinhibition)b3

反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)

b1竟争性抑制(competitiveinhibition)某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。加入竞争性抑制剂后，Km变大，酶促最大反应速度不变。竞争性抑制的动力学无抑制剂竞争性抑制剂1/Vmax1/v1/s竟争性抑制作用的例子：

在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。如：磺胺药、氨基叶酸等。用增加底物浓度的方法可以减弱抑制作用。磺胺药物的作用机制：叶酸是嘌呤核苷酸合成中重要辅酶_四氢叶酸的前身治癌药物的选用b2

非竟争性抑制(noncompetitiveinhibition)酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。

如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg）通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制；EDTA结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱加入非竞争性抑制剂后，Km不变，而Vmax减小。非竞争性抑制的动力学无抑制剂非竞争性抑制剂-1/km1/v1/sb3

反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而导致酶活性下降。这类抑制作用最不重要。反竞争性抑制的动力学无抑制剂反竞争性抑制剂1/1/[S]-1/km(1+[I]/ki)加入反竞争性抑制剂，使Km和Vmax均减小I增加可逆抑制的动力学比较无抑制剂VmaxKm竞争性抑制作用不变变大非竞争性抑制作用变小不变

反竞争性抑制作用变小变小一、酶活力与酶反应速度

二、影响酶促反应速度的因素底物温度pH值酶浓度激活剂抑制剂第四节酶促反应的动力学

Km米氏方程

非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂

专一性不可逆抑制剂

竞争性抑制剂(Km增加，Vmax不变)可逆抑制剂

非竞争性抑制剂(Km不变，Vmax降低)

反竞争性抑制剂(Km降低，Vmax降低)回顾第五节几种重要的调节酶一、别构酶（allostericenzyme）：（一）别构酶的概念和基本性质

别构酶也称变构酶，它是代谢过程中的关键酶。通过效应物（调节物）和酶的别构中心的结合来调节其活性，从而调节酶反应速度和代谢过程。别构酶的基本结构特性：

1.有多个亚基

2.有四级结构

3.酶分子中除了有结合底物并催化反应的活性中心外，还有可以结合调节物的别构中心。活性中心和别构中心可能位于不同的亚基或相同的亚基的不同部位。几个相关概念别构效应（allostericeffect）：调节物或效应物与酶分子上的别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶反应速度及代谢过程，此效应即为酶的别构效应。提高酶活性的别构效应称变构激活（allostericactivation

）或正协同效应（positivecooperativeeffect）降低酶活性的别构效应称变构抑制（allostericinhibition

）或负协同效应（negativecooperativeeffect）具有别构效应的酶叫别构酶，使别构酶产生别构效应的物质叫效应物（变构激活剂和变构抑制剂）同促效应（同种协同效应）（homotropiceffect）上述协同如果发生于底物之间，即效应物就是S，酶分子上有多个活性中心，先与酶活性中心结合的底物分子，对后续底物与酶分子其它活性中心的结合产生影响；异促效应（heterotropiceffect）：如果发生在效应物与底物之间。多数别构酶兼有同促效应和异促效应。（二）别构酶的动力学及别构酶对酶反应速度的调节1.大多数别构酶具有正协同效应（酶分子结合一分子底物或效应物后，酶的构象发生变化，这种新的构象有利于后续分子与酶的结合，大大促进后续分子与酶的亲合性），其初速度与底物浓度的关系呈S形的v-[S]曲线。当底物浓度发生很小的变化时，别构酶就极大地控制着反应速度。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。2.另一类别构酶具有负协同效应，其动力学曲线在表现上与双曲线相似，但意义不同[s]具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感正负（三）别构酶调节酶活性的机理齐变模型

1965Monod,Wyman,Changeuc提出（MWC模型）要点：酶分子中所有亚基都处于相同的构象状态，T态或R态.R态对底物的亲和力较大.T态较小。当酶分子中的一个亚基结合了效应物之后，构象发生改变T→R，导致其它所有亚基的构象一起变化，从而影响酶的催化活性。序变模型(KNF模型）1966年Koshland

、Nemethyl和Filmer提出的。别构酶中的一个亚基结合了效应物之后，构象发生改变，并导致其相邻的亚基的构象发生改变，这种构象变化依次传递，从而影响酶的催化活性。

KNF模型MWC模型二、同工酶（isoenzyme）1.概念

同工酶是指能催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、组成却有所不同的一组酶,一般为寡聚蛋白。2.同工酶举例：1959年，Marker首先用电泳分离法发现动物的乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）具有多种分子形式。LDH5(M4)、LDH4(M3H)、LDH3(M2H2)、LDH2(MH3)、LDH1(H4)但是H亚基与M亚基的一级结构有差异，从而LDH的5种同工酶的物理性质及生物学性质有差异。3、心、肝病变时引起的血清LDH同工酶的变化规律：

心脏疾病

LDH1和LDH2上升，LDH3和LDH5下降。

急性肝炎

LDH5明显上升，随病情好转而恢复正常。4.研究同工酶的意义（1）进行遗传分析、杂种优势的筛选、抗逆指标筛选（2）进行疾病诊断（3）研究代谢规律大肠杆菌中的天冬氨酸激酶同工酶天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰半醛同型丝氨酸

赖氨酸甲硫氨酸苏氨酸三种同工酶5.同工酶的形成

分为原级同工酶和次级同工酶。原级同工酶是指由不同基因编码而产生的同工酶如乳酸脱氢酶:基因的直接产物H和M亚基的不同聚合形式乳酸脱氢酶同工酶形成示意图

多肽亚基mRNA四聚体结构基因a

b乳酸脱氢酶同工酶电泳图谱+–H4MH3M2H2M3HM4点样线次级同工酶是指通过对多肽链的化学修饰（结合基团、结合糖链、肽链或酰胺键的水解），或者再经不同程度的聚合反应，使多肽链转变为不同的酶分子形式。

三、共价修饰调节酶

1.共价修饰（covalentmodification）：指在专一性酶的催化下，某些小分子基团共价地结合（或脱去）到被修饰的酶分子上，使被修饰酶的活性发生改变，从而调节酶活性。（1）共价修饰调节酶：即通过共价修饰调节活性的酶叫共价修饰调节酶。（2）共价修饰的类型：

磷酸化/去磷酸化（主要存在于高等动、植物细胞中）腺苷酰化/去腺苷酰化；（主要存在细菌中）乙酰化/去乙酰化；尿苷酰化/去尿苷酰化；甲基化/去甲基化；S-S/SH2、糖原磷酸化酶和糖原合成酶活性的调节

糖原的合成

糖原合成酶a

(脱磷酸化，有活性)

糖原磷酸化酶b

(脱磷酸化，无活性)ATPADPPiH2O糖原合成酶b（磷酸化，无活性)糖原磷酸化酶a（磷酸化，有活性）ATPADPPiH2O糖原的分解

1.酶原：酶的无活性前体。

2.酶原激活（不可逆的共价修饰）：某些酶先以无活性的酶原形式合成或分泌，然后在到达作用部位时由其它酶作用，使其失去部分肽段从而形成或暴露活性中心、形成有活性酶分子的过程。

3.酶原激活的实例

4.酶原激活的生理意义四、酶原激活胰蛋白酶原的激活及其功能

胰蛋白酶原六肽肠激酶Ca2+胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶原胰凝乳蛋白酶弹性蛋白酶原弹性蛋白酶羧肽酶原羧肽酶水解Arg

Lys羧基形成的肽键四种调节酶别构酶是寡聚蛋白，具有别构效应（allostericeffect）：调节物或效应物与酶分子上的别构中心结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响，从而调节酶反应速度及代谢过程，此效应即为酶的别构效应。同工酶共价修饰调节酶（小分子共价结合在酶分子上）酶原及其激活Ribozyme在一定条件下，高度专一地催化下列反应，具有相应酶的活性（底物专一、符合米氏方程、对竞争性抑制剂敏感）

1.核苷酸转移酶活性2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2.磷酸二酯酶活性CpCpCpCpC

CpCpCpC+Cp3.磷酸转移酶活性CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4.RNA限制性内切酶活性另外，1997年，Zhang和Cech证明了人工合成的RNA分子具有肽基转移酶活性。五、Ribozyme

（核酶）Ribozyme发现的重大意义：RNA具有酶的催化活性，向酶的化学本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。在理论上，对于生物起源和生命进化的研究具有重要启示。

生物催化分子进化的可能性：

RNARNA-蛋白质蛋白质-RNA蛋白质-辅酶或辅基蛋白质

在实践上，由于Ribozyme的内切酶活性，可定点切割mRNA，破坏mRNA，抑制基因表达，为基因、病毒和肿瘤治疗提供了可行途径。抗体酶—指具有催化活性的免疫球蛋白，即在其高可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性与酶的高效催化性相结合的产物。抗体酶的应用前景：

1.为蛋白质结构的研究提供新手段（专一性内切酶）

2.设计抗肿瘤等的新型生物药物

3.应用于工业制药（立体专一性抗体酶）六、抗体酶（abzyme）七、诱导酶诱导酶（inducedenzyme）指细胞内在正常状态下不存在或含量很少的一类酶，当加入诱导物后这种酶被诱导大量产生。诱导物一般是该酶的底物或底物类似物。第六节酶的分离纯化参考对蛋白质的分离纯化判断一种方法的好坏：一个是酶的总活力回收；一个是酶的比活力提高的倍数。

步骤

1234

总活力（U）6432

总蛋白质（mg）201052

比活力（U/mg）6/204/103/52/2

酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。

酶的纯化倍数：

酶的回收率：×100%若一个酶的分离纯化分为4步一步比活力第七节酶工程（enzymeengineering）简介一、酶工程的概念:1971年第一届国际酶工程会议上得到命名。主要研究：酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造及其在工、农、医药等领域的应用。即酶制剂在工业上的大规模生产及应用。天然酶在开发和应用方面受到限制：

1.酶的不稳定性

2.酶的分离、纯化较难，成本高，价格贵目前在酶的应用方面所采取的一般方法：

1.化学方法：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质以提高酶的效率和降低成本，或通过化学合成法制造人工酶。

2.利用基因重组技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计新基因，生产出性能稳定、具有新的生物活性以及催化效率更高的酶。二、化学酶工程：化学酶工程亦称初级酶工程，指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。

1.天然酶：主要指工业用酶，从微生物发酵得到的酶。如：洗涤剂、皮革生产中用的蛋白酶；纸张制造用的淀粉酶；乳制品用的凝乳酶等。

2.化学修饰酶：用于医药及研究工作。通过（1）

化学修饰酶的功能基；（2）通过交联反应；（3）大分子修饰作用（用葡萄糖修饰SOD增加其半寿期，提高耐热性、耐酸碱性等。用葡萄糖和聚乙二醇修饰尿激酶等）。

3.固定化酶(immobilizedenzyme)：将水溶性酶用物理或化学方法，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。

4.人工模拟酶—化学法合成酶（已知酶的活性中心和作用机理）。3.固定化酶1971年在第一届国际酶工程会议上正式采用固定化酶名称酶的固定化方法：物理法：吸附法和包埋法化学法：共价偶联法和交联法目前，我国利用固定化氨基酰化酶拆分DL-AA；固定化的葡萄糖异构酶生产高果糖玉米糖浆；三、生物酶工程：生物酶工程亦称高级酶工程，是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。生物酶工程的主要内容：克隆酶—用基因工程技术大量生产酶（

-淀粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）突变酶—对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（改变酶的催化活性、底物专一性、最适pH、改变酶的别构调节能力、改变酶对辅酶的要求、提高酶的稳定性）

制造新酶—设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶第八节维生素与辅酶、辅基

VitaminandCoenzyme维生素的定义维生素（F.G.Hopkins）是机体（动物、植物和微生物）维持正常生命活动所必不可少的一类小分子有机化合物。维生素的发现（源于医药实践和科学实验；1906年来自动物实验）维生素一般习惯分为脂溶性和水溶性两大类。其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。辅酶coenzyme和金属离子根据酶的组成情况，可以将酶分为两大类：单纯蛋白酶：它们的组成为单一蛋白质.结合蛋白酶：某些酶，例如氧化-还原酶等，其分子中除了蛋白质外，还含有非蛋白组分.结合蛋白酶的蛋白质部分称为酶蛋白，非蛋白质部分包括辅酶、辅基或金属离子(或辅因子cofactor)。酶蛋白与辅助成分组成的完整分子称为全酶。单纯的酶蛋白无催化功能.一、水溶性维生素与辅酶、辅基某些小分子有机化合物与酶蛋白结合在一起并协同实施催化作用，这类小分子能用透析或超滤等方法除去，被称为辅酶,不能除去的叫辅基.辅酶或辅基是一类具有特殊化学结构和功能的化合物。参与的酶促反应主要为氧化-还原反应或基团转移反应。大多数辅酶的前体主要是水溶性B族维生素。VB1(硫胺素)（植物种子、胚芽、芹菜、白菜

瘦肉、酵母等)硫胺素(维生素B1)在体内以焦磷酸硫胺素(TPP)形式存在。缺乏时表现出多发性神经炎、皮肤麻木、心力衰竭、四肢无力、下肢水肿。12345嘧啶环噻唑环实质是盐酸硫胺素1.VB1(硫胺素)和焦磷酸硫胺素(TPP)焦磷酸硫胺素是脱羧酶的辅酶，它的前体是硫胺素(维生素B1)。功能：是催化-酮酸的脱羧反应噻唑环C2活性乙醛

TPP在丙酮酸脱羧中的作用机制VB1缺乏的病因:缺乏VB1使乙酰COA形成受阻,从而影响乙酰胆碱合成,影响神经传导,导致肠胃蠕动减缓,消化不良,食欲不振等

2.核黄素（VB2)核黄素(维生素B2)由核糖醇和7，8-二甲基异咯嗪两部分组成。核黄素是氧化-还原酶的辅基FMN和FAD的组分。11015VB2N1和N5上活泼双键易接受H+和给出H+

2.VB2(核黄素)和FAD和FMNFAD(黄素-腺嘌呤二核苷酸)和FMN(黄素单核苷酸)是核黄素(维生素B2)的衍生物，功能：在脱氢酶催化的氧化-还原反应中，起着电子和质子的传递体作用。2FMN和FAD的氧化-还原反应

FMNFMNH2

FADFADH2+2H-2H+2H-2HVB2来源：肝脏、酵母、大豆、小麦、青菜、米糠和蛋黄等缺乏时组织呼吸减弱，代谢强度降低。主要症状为口腔发炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。3.VB3(泛酸)和辅酶A(CoA)及ACP维生素(B3)-泛酸是由，-二羟基--二甲基丁酸和一分子-丙氨酸缩合而成。3.VB3(泛酸)和辅酶A(CoA)及ACP辅酶A是生物体内代谢反应中乙酰化酶（酰基转移酶）的辅酶，它的前体是维生素(B3)泛酸。功能：辅酶A是传递酰基，是形成代谢中间产物的重要辅酶(CoAACP)。-巯基乙胺3‘-P-ADP

辅酶A(CoA)的作用机制-+-硫酯键易水解，具有较高的基团转移能力组成酰基载体蛋白

（acylcarrierprotein,ACP)：4-磷酸泛酰巯基乙氨通过共价键与酰基载体蛋白的Ser-OH相连。4-磷酸泛酰巯基乙胺食物中泛酸相当丰富，且动物肠道内细菌可合成，极少发生缺乏。来源：肝脏、肾、蛋、小麦、米糠、花生、豌豆、蜂王浆4.维生素B5（维生素PP）与NAD+和NADP+维生素B5包括烟酸和烟酰胺，烟酰胺在体内转变为辅酶I（NAD+）和辅酶II（NADP+）。NAD+、NADP+是多种重要脱氢酶的辅酶能维持神经组织的健康。缺乏时表现出神经营养障碍，出现皮炎。吡啶环（尼克酸，nicotinicacid）（尼克酰胺，nicotinamide）

NAD+(烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又称为辅酶I)和NADP+(烟酰胺-腺嘌呤磷酸二核苷酸,又称为辅酶II)是维生素烟酰胺的衍生物功能：是多种重要脱氢酶的辅酶。4NAD（P）+NAD（P）H44来源广泛：肝脏、酵母、花生、谷类、豆类、肉类5.维生素B6(吡哆素)吡哆素(维生素B6，包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺)。磷酸吡哆素主要包括磷酸吡哆醛（pyridoxalphosphate,PLP）和磷酸吡哆胺（pyridoxaminephosphate,PMP）。磷酸吡哆素是转氨酶、脱羧酶、消旋酶的辅酶，转氨酶通过磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺的相互转换，起转移氨基的作用。磷酸吡哆素的作用机制来源广泛：五谷杂粮肠道细菌合成，一般很少发生缺乏症。

转氨基作用

α-氨基酸1

R1-CH-COO-

NH+3

|α-酮酸1

R1-C-COO-O||

R2-C-COO-O||α-酮酸2

R2-CH-COO-

NH+3

|α-氨基酸2转氨酶（辅酶：磷酸吡哆醛）6.生物素（VB7，维生素H）生物素是羧化酶的辅基。羧化酶的功能是作为CO2的递体，在生物合成中起传递和固定CO2的作用。在光合作用和脂肪合成中有重要意义。脲噻吩戊酸侧链生物素羧化酶的作用机制+HCO3-生物素-酶CO2-生物素-酶来源广泛：肝脏、肾、蛋黄、酵母、蔬菜、五谷杂粮人和动物肠道细菌能合成生物素，一般很少出现缺乏症。但大量食用生鸡蛋清可引起生物素缺乏，卵清中含有抗生物素蛋白——avidin，能够和生物素结合成无活性又不能够消化吸收的物质。7.VB11(叶酸)和四氢叶酸(FH4或THF)二氢叶酸对氨基苯甲酸谷氨酸蝶呤功能：叶酸还原生成FH4（还原酶的辅酶是NADPH+H+）8四氢叶酸HH105四氢叶酸的主要作用是转移一碳基团酶系的辅酶，作为一碳基团，如-CH3,-CH2-,-CHO等的载体，参与多种生物合成过程。FH4是传递一碳单位的辅酶传递的一碳单位有：甲基、亚甲基（甲叉）、甲川基、甲酰基、亚胺甲基活性位点：N5、N10来源广泛：肝脏、肾、酵母肠道细菌合成咕啉环5，6-二甲基苯并咪唑核苷酸8.维生素B12与辅酶B12

又称为氰钴胺素结构：功能：维生素B12中与Co+相连的CN基被5’-脱氧腺苷取代，形成维生素B12辅酶。

HH-OOC-C-CH2

-OOC-C-CH3HCH-COO-CH-COO-NH3+NH3+缺乏VB12人易患恶性贫血，但人和动物的肠道细菌都能合成VB12,故一般情况不会缺少。来源于动物性食品：肉类、肝谷氨酸变位酶维生素B12辅酶的主要功能是参与分子内重排如作为谷氨酸变位酶的辅酶，参与氢与邻近碳上另外取代基的交换。9.硫辛酸硫辛酸是不属于维生素的辅酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸，有两种形式，即硫辛酸（氧化型）和二氢硫辛酸（还原型）.硫辛酸在糖代谢中起到重要作用，是丙酮酸和酮戊二酸脱氢酶的辅酶，在氧化脱羧过程中传递酰基和氢。+2H-2H通常硫辛酸的COOH与酶分子赖氨酸的ε-氨基以酰胺键相连。NHRLNAD++H+丙酮酸脱羧酶FAD硫辛酸乙酰转移酶二氢硫辛酸脱氢酶CO2乙酰硫辛酸二氢硫辛酸NAD++H+TPP硫辛酸CoASHNAD+CH3-C-SCoAO功能部位传递酰基和H+来源广泛：肝、酵母等丙酮