组织培养 整理

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1.1植物组织培养的一般概念广义的组织培养，不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。Gamborg曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养，悬浮细胞培养、器官培养(胚、花药、子房、根和茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养。其中愈伤组织培养是一种最常见的培养形式。1.1植物组织培养的一般概念所谓愈伤组织，原是指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。愈伤组织培养所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株，此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源在组织培养中，当我们把分化组织中的不分裂的静止细胞，放在一种能促进细胞增殖的培养基上以后，细胞内就会发生某些变化，从而使细胞进入分裂状态。一个成熟细胞转变为分生状态的过程叫做脱分化。在组织培养中，我们把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体一个成熟的植物细胞经历了脱分化后之所以还能再分化而形成完整的植株，是因为这些细胞具有全能性。所谓全能性，就是说，任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。对已分化的细胞的全能性的实验研究表明，至少在某些情况下，发育和分化过程并不导致细胞中遗传信息的丢失或不可逆的钝化，所涉及的只是这些遗传信息表达调控机制的改变。有关全能性的肯定实验证据是Steward等人(1958)在以胡萝卜根组织为外植体的组织培养实验中得到的。当他们把栽培胡萝卜次生韧皮部薄片培养在一种含有椰子汁的固体培养基上时，产生了由简单的薄壁细胞组成的愈伤组织。把这些愈伤组织转入到成分相同的液体培养基中并不断振荡，又产生了由单个细胞和小细胞团组成的悬浮液。全能性只是一种可能性，由以上的介绍我们可以看到，要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使这部分细胞处于离体的条件下，二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历上面所说的两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。脱分化是指植物在组织培养时，在激素调节下由成熟组织的细胞（如叶细胞）转变为分生状态的过程。再分化是指在植物组织培养过程中，分生状态的细胞在激素的作用下分化转变为成熟组织或器官的过程。脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式，一种是器官发生方式，其中茎芽和根是在愈伤组织的不同部位分别独立形成的，形成的时间可能也不一致，它们为单极性结构，里面各有维管束与愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间并没有共同的维管束把二者连在一起，另一种是胚胎发生方式，即在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，或称体细胞胚，它们经历的发育阶段与合子胚相似，成熟胚状体的结构也与合子胚相同。胚状体是双极性的，有共同的维管束贯穿两极，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。一般认为，愈伤组织中的不定芽起源于一个以上的细胞，而体细胞胚只起源于一个细胞，因此由体细胞胚长成的植株各部分的遗传组成应当是一致的，不存在嵌合现象，不过也有些作者在这类再生植株中同样发现了嵌合现象，因此认为体细胞胚也起源于一个以上的细胞。胚状体：在愈伤组织形成以后，培养的细胞团中开始形成结构紧实，解剖结构类似于胚的单细胞来源的培养物。我们称之为胚状体。在很多植物中，胚状体的结构都是相当典型的，但在有些植物如小麦中，幼龄胚状体的盾片往往变大变绿，形成通常所描述的“叶状结构”，并且常常出观早熟萌发的现象。胚状体与不定芽的区别①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象胚状体与合子胚的比较

合子胚胚状体质量萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源受精卵体细胞胚柄有，明显即使有也不明显形态固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率低高通过胚状体途径产生再生植株有3个显著的优点，首先，在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽的数目多(例如在一个离体培养的烟草花药上可以产生200个以上的胚状体);其次，胚状体形成的速度快，第三，胚状体结构完整，一旦形成，一般都可直接萌发形成小植株，因此成苗率较高。1．2植物组织培养的发展简史虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近五十年来的事，但它的整个历史可以追溯到十九世纪末和二十世纪初。从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段：本世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点。为了论证这一观点，他在加入了蔗糖的Knop溶液中培养单个离体细胞，所选用的材料是小野芝麻和凤眼兰的栅栏组织和虎眼万年青属植物的表皮细胞等。遗憾的是，虽然在栅栏细胞中他明显看到了细胞的生长、细胞壁的加厚和淀粉的形成等，但没有一个细胞在培养中能够发生分裂。Haberlandt实验失败的原因，现在看来主要在于两点：第一，他所选用的实验材料都是已经高度分化了的细胞，第二，所用的培养基过于简单，特别是培养基中没有包含诱导成熟细胞分裂所必需的生长激素，这是因为生长激素在当时还没有发现。然而，做为植物组织培养的先驱者，Haberlandt的贡献不仅在于首次进行了离体细胞培养的实验，而且在其1902年发表的“植物离体细胞培养实验”的报告中，还提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见。自Haberlandt的实验之后，直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，在其间的32年时间里，植物组织培养技术几乎没有什么进展，只是在以下两个方面进行了一些初步的探索。Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性；到了30年代中期，植物组织培养领域里出现了两个重要的发现，其一是，认识了B族维生素对植物生长的重要意义，二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。导致这两个发现的主要是White和Gautheret的实验。1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来(1937)，他用3种B族维生素，即吡哆醇，硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。在这个以后被称为White培养基的合成培养基上，他把某些于1934年建立起来的根培养物一直保存到1968年他逝世前不久。与此同时，Gautheret(1934)在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加.由于这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。40年代和50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这些实验结果导致了激动素的发现和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作的开展。在40年代，组织培养技术的另一项发展是Overbeek等(1941)首次把椰子汁做为补加物引入到培养基中，使曼陀罗的心形期幼胚能够离体培养至成熟。到50年代初，由于Steward等在胡萝卜组织培养中也使用了这一物质，从而使椰子汁在组织培养的各个领域中都得到了广泛应用。50年代开始以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引入注目的进展就有以下6项：1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株1953～1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。方法是把万寿菊(Tageteserecta)和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，使组织破碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液，然后通过继代培养进行繁殖。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂。这种“看护培养”技术揭示了实现Haberlandt培养单细胞这一设想的可能性。1955年，Milier等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素(kinetin)。现在，具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素(cytokinin)。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织(如叶肉和干种子胚乳)的细胞进行分裂。1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的。后来，Murashige发展了这一方法，制订了一系列标准程序，把这一方法广泛用于由蕨类植物到花卉和果树的快速繁殖上。1958～1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物如胡萝卜和毛茛中，事实上由植物体的任何部分都可以得到体细胞胚。60年代以来组织培养技术所以得到了迅速发展，一方面是由于有了前60年建立的理论和技术基础，另一方面是由于这项技术开始走出了植物学家和植物生理学家的实验室，通过与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，在植物改良中发挥了重要的作用，并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。60年代以来组织培养技术的发展，概括起来可以分为三个方面：(1)原生质体培养取得重大突破1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功，大大激发了人们对原生质体培养的热情。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材在1985年以前，作为粮食和饲料主要来源的禾谷类植物的原生质体培养鲜有突破，只是最近几年间，水稻、玉米、小麦、高梁、谷子和大麦等的原生质体培养才相继告捷。在这方面，中国学者做出了重要贡献。原生质体培养的成功，促进了体细胞融合技术的发展。(2)花药培养取得显著成绩1964年，Guha和Maheshwari报道，在南洋金花中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合化过程中的重要作用，这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展，获得成功的物种数目增加到160余种，其中包括很多种重要的栽培植物。烟草、水稻和小麦等的花培育种在中国取得了引人注目的成就。(3)微繁技术得到广泛应用1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业”，目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，在其他很多观赏植物和经济作物(如甘蔗和草莓等)中，微繁也已达到了工厂化的生产规模，在若干作物中与通过茎尖培养进行脱毒相结合，产生了可观的经济效益。1．3组织培养与农业的关系组织培养一方面可为遗传工程提供理想的受体材料，另一方面又可为常规的植物改良程序提供一种新的手段，从而使很多用传统方法难以解决的问题迎刃而解，更多更快更好地创造出各种农作物和园艺植物的新品种、新类型和新种质。例如：——在自花授扮作物杂交育种中，或在异花授粉作物自交系选育过程中，采用花药培养技术不但可缩短杂合体纯合化所需的时间，而且还可以节省土地面积，假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同，通过花药培养，在理论上只要有2n个F1代花粉植株，就有可能得到一个所需要的基因组合，而利用传统育种方法，则至少要有4n个F2植株才能得到这样一个组合。——在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。——对于无药可治的病毒病，可通过茎尖培养消除病毒，这对解决马铃薯种薯退化问题能发挥重要作用，在其它很多植物中也可用以建立无毒原种。——通过离体诱导不定芽或促进腋芽生枝，可对很多重要的园艺植物和名贵花卉、树种进行快速繁殖。——应用在细胞水平上进行突变体选择的技术，可以在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而大大提高选择效率，节省时间和土地面积，并且不受季节的限制。——体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源，这种变异在育种中的利用价值已经引起人们的广泛注意。——通过用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为某些稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。利用药用植物进行组织培养，生产有价值的次生代谢产物。如人参，三七中的药用成分（皂苷）可以大量生产。——特别是在无性繁殖植物中，通过对茎尖分生组织等离体材料进行超低温保存，不但可以大大节省空间，而且还不致受到病虫害的侵袭，并便于无毒种质的国际交换。2．1引言一个组织培养实验室的面积大小和装备程度取决于两个因素：一是所要进行的实验的性质，二是所能得到的经费的多少。然而，一个标准的组织培养实验室应当具备的设施：①玻璃器皿、塑料器皿和其他实验器皿的清洗和贮存；②培养基的制备、灭菌和贮存；③植物材料的无菌操作④将培养物保持在温度、光照、可能时还有湿度的可控条件下；⑤培养物的观察。为此至少需要有两个隔开的房间：一间用于玻璃器皿的清洗和贮存，以及培养基的制备(培养基室)，第二间用于放置培养物(培养室)。培养室内应放一张桌子，上置双筒解剖镜和所需的光源，以便对培养物进行镜检。2．2．1培养基室配制培养基所需的一般设备包括：①工作台——其高度应适合于站着工作，②低温冰箱——用以贮存贮备液和椰子汁等，若无低温冰箱，在普通冰箱内也可短期贮存，③普通冰箱——用以贮存各种化学药品、植物材料，和短期贮存贮备液等；④大塑料瓶——用以贮存蒸馏水；⑤天平；⑥电热磁搅拌器——用以溶解化学药品⑦酸度计⑧吸气机或真空泵——用以辅助过滤灭菌；⑨恒温水浴锅——用以融化琼脂，⑩高压灭菌锅或家用压力锅——用以进行培养基灭菌2．2．2培养容器各种不同类型的容器都可用来培养植物材料。玻璃试管广口玻璃瓶牛奶瓶和罐头瓶塑料容器耐高温高压的透明塑料封口，橡皮圈箍扎2．2．3培养室培养室的温度应当是可控的，一般是用空调或热风机使温度保持在25±2℃培养一般是在散射光下进行的，但有些情况下也需要较强的光照或完全黑暗，设备上对此应当有所准备。当培养室的相对湿度降到50％以下时，应采取措施增加湿度。一般应75%相对湿度。进行悬浮培养，培养室内还应设有摇床最好设置一台备用发电机在培养室内应设有若干培养架以放置培养物，每层分别装有日光灯管，小风扇。2．3技术

2．3．1玻璃器皿和塑料器皿的清洗传统办法是用洗液(重铬酸钾和浓硫酸混合液)浸泡约4h现在都使用特制的洗涤剂放入高压锅中灭菌超声波洗涤柜2．3．2灭菌培养基的污染有几个可能的来源：1培养容器，2培养基本身，3外植体，4接种室的环境，5在接种和继代时用以操作植物材料的器械，6培养室的环境。下面讨论防止由这些来源造成污染的各种措施1．培养基置于高压灭菌锅中，由培养基达到要求温度的时刻算起，在1．06kg／cm2的压力下(121℃所需的时间随着要进行消毒的液体的容积而变化当冷却被消毒的溶液时必须十分当心，如果压力急速下降，超过了温度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器中溢出。只有当高压灭菌锅的压力表指针回到零(温度不高于50℃某些生长调节物质(如GA，、玉米素，ABA)，尿素以及某些维生素等，遇热时容易分解，不能进行高压灭菌。热分解化合物溶液的灭菌是通过滤膜过滤进行的，然后再将之加入高压灭菌过的培养基中在进行溶液过滤消毒时，可使用孔径为0．45微米或更小的细菌滤膜。过滤器的灭菌温度非常重要，不应超过121℃过滤灭菌的操作：把一个装有需要灭菌的溶液的带刻度注射器(不必消毒)安到已灭过菌的过滤器组件的一端，缓慢地推动溶液使之穿越安在这个过滤器组件中间的细菌滤膜，过滤后的溶液由过滤器组件的另一端滴下来，直接加入培养基中2．玻璃器皿、塑料器皿和器械玻璃培养容器常常与培养基一起灭菌对于无菌操作所用的各种器械，如镊子、解剖刀、解剖针和扁头小铲等，一般的消毒办法是把它们先在95％酒精中浸一下，然后再置火陷上灼烧，待冷却后使用。3．植物材料有若干种灭菌剂可用来进行植物组织消毒，应当正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以尽量减少组织的死亡。一般来说，如果外植体较硬较大，容易操作，可直接用灭菌剂进行处理。若要培养柔嫩的茎尖或花粉粒，须分别把茎芽或花蕾进行表面消毒，然后在无菌条件下取出外植体。这类外植体一般都不带污染微生物4．接种区最后必须特别强调的一点是，无论是接种还是继代，当培养容器敞着口的时候，必须从各方面注意防止任何污染物进入容器，为此所有的操作都必须在严格的无菌条件下进行。近年来多数实验室都使用各种类型的超净工作台进行无菌操作。超净工作台----内都装有一个小电动机,粗过滤器,细过滤器,空气的速度大约是27±3m／min。植物组织无菌培养的一般步骤植物组织无菌培养的一般步骤置于一个有螺丝盖的玻璃瓶中浓度适当的消毒液无菌蒸馏水3～4次将材料取出，置于一个已经灭过菌的培养皿中对所要使用的器械进行消毒使用这些消过毒的器械外植体接种到培养基上瓶口置酒精灯火焰上烘烤数秒钟，然后迅速用瓶盖或瓶塞封严第三章培养基1培养基的种类及组成培养基：供植物离体培养用的基质，相当于人工配制的“土壤”。由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质、有机附加物、水和介质等几大类组成，为培养物提供营养、水分和固定场所。在植物生物技术的发展进程中，研究者们根据不同的研究目的和培养物对营养的需求，开发出数十种组份各异的培养基配方（见附录I）。对于培养基的命名，一般采用“发明人＋发表年份”或“培养基代号＋发表年份”表示，例如Murashige和Skoog（1962）也可表示为MS（1962）。培养基的类别，依据形态不同可分为固体培养基和液体培养基，前者因加有固化剂如琼脂或卡拉胶而呈固体状态，后者不加固化剂，培养基为液体。两类培养基的操作和使用目的差别较大依据培养基中是否加有生长调节物质和附加物质，则可将培养基分为基本培养基和完全培养基，前者只含有无机营养物（包括大量元素和微量元素）、维生素、氨基酸、碳水化合物和水。后者在前者，即基本培养基的基础上，根据各种不同试验要求，附加一些物质，如各种植物生长调节剂：BA、ZT、KT、2-iP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等，以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。由于离体的培养材料不象完整植物体那样具有自我平衡的能力，所以在配制培养基时，还应考虑离子平衡和物质平衡问题，离子失衡或某种物质过量都可能导致培养物死亡。目前，无论液体培养还是固体培养，大多数植物离体培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类组成.1.1无机营养物（无机盐类）无机营养物主要包括大量元素和微量元素，有时也包括少许有益元素。大量元素包括N、P、K、Ca、Mg、S，它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。1.1无机营养物（无机盐类）-NN通常为硝态氮或铵态氮，在培养基中多以KNO3或NH4NO3的形式提供，或将硝态氮与铵态氮配合使用，培养基中一定浓度的氮素不仅为培养物的生长提供营养，而且是胚胎发生的必需条件之一。一般而言，培养基中至少需要含有各为25mmol.L-1的硝酸盐和钾盐。铵的含量超过8mmol.L-1时对培养物有毒害作用，但对常规的愈伤组织培养和细胞悬浮培养来说，若硝态氮和铵态氮同时存在，则培养基中的总N量可提高到60mmol.L-1。1.1无机营养物（无机盐类）-P.KP是植物的必需元素之一，参与生命活动中核酸及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量的贮存、转化与释放等重要的生理生化过程，在离体培养中需要大量的P；K是主要的阳离子，近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势；Ca、Mg、S的用量相对少一些，浓度在1～3mmol.L-1范围内较适宜。1.1无机营养物（无机盐类）微量元素是指Fe、Cu、Mn、B、Zn、Mo和Cl等，其需要量很少，一般用10-5～10-7mol.L-1,过多则产生毒害。另外，Cl在自然界广泛存在，一般无须另行添加。有益元素是指非必需的、但对培养物的生长发育有益的一些元素，如硅（Si）、碘（I）、硒（Se）、钴（Co）和钠（Na）等，在某些植物如水稻、盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物的离体培养中常有使用，另外，几乎所有的培养基配方中都含有碘元素。各种元素中，除Fe以螯合形式(如Fe-EDTA)供给、少部分的氮素由有机氮供给外，其它的元素一般以离子态提供。1.2碳源（carbonsources）和能源离体培养中的外植体材料，由于其光合作用能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源，这些碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最为重要。它们的作用除了提供培养物所需的碳骨架外，还提供能源，并可调节渗透压一般地说，蔗糖是最好的糖源。它具有热易变(heat-liable)的性质，经高压消毒后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，有利于培养物吸收。其次，是葡萄糖和果糖。棉子糖在胡萝卜离体培养中的作用，仅次于蔗糖和葡萄糖，但比果糖效果好。山梨糖（醇）则是蔷薇科植物培养物的最好或较好的糖源，这可能与它在蔷薇科植物活体中也是最占优势的糖类物质有关。淀粉作为碳源对含糖量较高的植物组织来源，有较好的效果。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1～5%（可维持的渗透压范围在-152～-145kPa），过低的糖浓度不能满足细胞营养、代谢和生长的需要，但过高的糖也是不利的，可能会干扰正常糖类物质的代谢，或导致培养系统的渗透压增加，从而阻碍了细胞对水分的吸收。在幼胚培养、花药培养和原生质体培养时，需要较高浓度的糖类物质，一般为10%左右或更高。原生质体培养时，若糖类(以及醇类)的浓度不够高，原生质膜外的渗透压比膜内的低得多，原生质体就会破裂除单糖外，其他糖一般须在细胞体外分解后而被吸收。植物细胞壁中存在着各种水解酶。胡萝卜的转化酶比较弱地结合在细胞壁中，若用酶法制取原生质体，有50～60%的酶稀释于培养基中。若以蔗糖为糖源对这种细胞进行液体培养，则大约经12小时后，绝大部分解为葡萄糖和果糖。维生素类维生素类的种类很多，与植物体内各种酶的形成有关。由于离体培养中外植体合成维生素的能力较弱，需加部分的外源维生素才能利于发育。在离体培养中通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.1～10mg.L-1。其中，盐酸硫胺素（VB1）是几乎所有的培养物所必不可少的，而烟酸、盐酸吡哆素(VB6)、生物素及维生素C和B12也比较常用。VB1用量在0.1～0.3mg.L-1之间，特别是在低水平细胞分裂素的培养基中，更是不可少肌醇（环己六醇）是一种特殊的物质，其本身不促进外植体的生长，但可能有助于化学物质发挥作用，特别是能提高VB1的效果，从而促进外植体生长、胚状体发育和芽的分化，肌醇的用量为50～100mg.L-1。维生素类一般易溶于水，但耐热性差，高温下易降解。1.4氨基酸、酰胺类及有机附加物在一些培养基中加入一些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，除提高营养外，可起到缓冲和调节培养物的体内营养平衡的作用，能够促进离体根的生长，促进培养物的生长发育。例如丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体和不定芽的分化，水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）含有多种氨基酸，对胚状体或不定芽的分化也有良好的促进作用氨基酸的通常用量为2～3mg.L-1，水解酪蛋白和水解乳蛋白的用量一般为0.05～0.1%。此外，有些情况下还可加入成份更复杂的天然复合物质，包括天然营养物、中草药甚至保健品等，常用的为椰乳、酵母提取液、番茄汁和香蕉泥等，使用浓度分别为10～20%、0.5%、5～10%和100～200g.L-1，这些物质中含有天然激素等多种活性物质，香蕉泥还具有较好的pH缓冲作用，在兰花离体培养中应用较多。椰乳（CM，CW）的活性成分是耐热的，其制备方法为，将新鲜椰子汁煮沸后用数层纱布过滤，去除蛋白质后冰冻保存备用。1.5植物生长调节剂生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽然极少，但对外植体愈伤组织的诱导和分化起着重要和明显的调节作用，其中最常用的是生长素类和细胞分裂素类。１）生长素类生长素类是一类刺激细胞伸长的化合物，能引起细胞性质或次级代谢机能变化。生长素的主要作用是促进细胞伸长和细胞分裂，诱导受伤组织表面的一至数层细胞恢复分裂能力，形成愈伤组织、促进胚状体的分化和试管苗的生根，另外，当生长素与一定比例的细胞分裂素配合使用时，还能诱导腋芽及不定芽的产生。常用的生长素有2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）和IAA（吲哚乙酸）等，它们的活性强弱顺序为2,4-D>NAA>IBA>IAA。IAA的使用浓度一般为10-5～10-10mol.L-1，常用1～10mg.L-1，2,4-D为10-5～10-7mol.L-1，NAA的浓度范围则比前两者都大IAA是生物合成的激素，见光或在酶促氧化作用下容易降解失活。另外，因培养物细胞内含有IAA氧化酶，会破坏外源IAA的活性，故IAA的使用浓度一般较高（1～30mg.L-1），NAA和2,4-D是人工合成的生长调节剂，性质稳定，不会被酶氧化和降解，使用浓度以一般以0.1～2mg.L-1为宜。２）细胞分裂素类现已发现天然的细胞分裂素物质约十多种，同时也有一些人工合成的物质具有细胞分裂素活性，这些物质统称为细胞分裂素。常用的细胞分裂素有激动素（KT）、6-卞基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-异戊烯腺嘌呤（2-iP）、腺嘌呤（AD）、二苯脲、吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ，又名苯基噻二唑基脲）等.它们的主要作用是：①促进细胞分裂与扩大；②诱导芽的分化，促进侧芽的萌发与生长；③增强蛋白质的合成，抑制衰老；④能够改变其它激素的作用。其活性的强弱顺序为TDZ，4PU>ZT>2-iP>6-BA>KT>AD。最常用的分裂素是性质稳定、价格适中的6-BA和KT，使用浓度为10-6～10-7mol.L-1。３）赤霉素类赤霉素（GA），市售的GA是赤霉菌发酵液的粗提物，含有多至15种的赤霉素，离体培养中使用的赤霉素一般是赤霉酸（GA3），也是一种天然产物，溶于甲醇、乙醇或碳酸氢钠溶液，在水中会迅速分解，故需用乙醇溶解并保存。赤霉素的主要作用是，诱导茎的细胞伸长，对根的细胞则无效；对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用，即IAA/GA比值高有利于木质部分化，比值低则利于韧皮部分化；可以代替低温和长日照，使一些两年生植物在当年就开花，加快发育进程，具有打破休眠、促进休眠种子和器官萌发的作用；此外，赤霉素还对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。（４）脱落酸（ABA）除特殊的研究外，植物离体培养中一般不使用脱落酸，但了解脱落酸的知识是很有必要的，它可以帮助我们考虑和分析问题，如激素间的相互作用、采样时期、环境条件、培养基及培养条件的状况对培养材料的影响等。一般地，脱落酸具有抑制蛋白质合成、抵消或抑制生长素、细胞分裂素和赤霉素发挥作用的功效，并能够诱导休眠、促进衰老和脱落的发生。但是，也有报道认为ABA对培养物的形态发生有促进作用，例如甘薯块根和柳杉下胚轴切段培养物产生芽，荔枝幼胚培养产生胚状体等。近期植物生理学的研究进展表明，脱落酸是一类生理作用相当复杂的激素，它在离体培养中的作用需要进一步的研究。（５）乙烯及其它生长抑制剂几乎所有的植物组织都能产生乙烯。乙烯的生理作用有，促进果实成熟、促进脱叶和衰老；促进次生物质的排泌；促进菠萝开花、增加黄瓜等的雌花数量等在离体培养中，生长素用量过高会诱发产生乙烯；当培养物生长得太密集拥挤、长期不予继代转接时，乙烯含量会增高，从而加速培养物衰老或脱叶，较高的乙烯还引起植物在形态上的一些改变，如使豌豆的上胚轴加粗、失去负向地性等。除此之外，离体培养中有时还会用到多效唑、烯效唑、三碘苯甲酸（TIBA）、矮壮素、比久（B9）、根皮苷、间苯三酚（根皮酚）等生长抑制剂，用以抑制徒长或细胞的旺盛分裂，提高试管苗的质量。有研究证明根皮苷可提高莲叶秋海棠、雪松、月季的芽苗分化，根皮苷分解后产生的根皮酚也有类似的效果，三碘苯甲酸则能够促进秋海棠的离体培养叶片形成芽。根皮苷的用量一般为1～7mg.L-1。1.6琼脂或卡拉胶琼脂是从红藻等海藻中提取的一种高分子碳水化合物，其主要作用是使培养基在常温下凝固，它不参与代谢、不提供营养（但不纯的琼脂中常会有一些微量元素），在植物离体培养中一直被作为首选的固化剂。琼脂的用量一般在4～10g.L-1之间。近年来一些厂家生产的“卡拉胶”为粉状的琼脂，其用量应小于条状琼脂如果是研究植物组织或细胞的营养问题，则应避免使用琼脂，因为市售的琼脂几乎都含有一些杂质，特别是钙、镁和一些微量元素。琼脂纯化：为了得到更纯净的琼脂，可将干琼脂450g放在8L大瓶中，加蒸馏水5L和吡啶0.5L，20小时后滤去液体，用蒸馏水冲洗3次，再用95％酒精浸泡12小时，取出并晾干。琼脂的凝固能力除与原料、厂家和加工方式有关外，还与高压灭菌的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸及高温会使琼脂发生水解，失去凝固能力。存放时间过久，也会逐渐失去凝固力，在使用中应注意1.7活性炭活性炭的作用,利用其吸附能力降低分泌物的毒害作用;可使培养基变黑，有利于大多数植物的离体生根；对形态发生和器官形成有良好的效应.例如，活性炭可以促进花药培养时的雄核发育，有利于形成单倍体植株；悬浮培养的胡萝卜细胞失去胚状体发生能力后，通过添加1～4%的活性炭可恢复其胚胎发生能力。一般认为，活性炭具有强大的吸附能力，能够吸附非极性物质和色素等大分子，但其吸附的选择性很差，既吸附有害物质，也吸附有利物质如激素和维生素类等，故使用的浓度不宜过高，一般在0.1～0.5%。活性炭的吸附能力还与温度有关，低温下吸附能力强，高温下吸附能力减弱，甚至解吸附。另外，大量的活性炭会削弱琼脂的凝固能力，此时需提高琼脂的用量，很细的活性炭粉末容易沉淀，应在培养基凝固之前摇晃混匀1.8硝酸银AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，能起到抑制乙烯活性的作用。因此，在培养基中加入适量的AgNO3，有促进愈伤组织分化器官或胚状体的作用，能使某些原来再生困难的物种再生植株，并对克服试管苗玻璃化、早衰及落叶等有明显效果。1.9染色剂的利用在进行离体培养研究时通常需配制不同的培养基，或加入不同的植物激素，以观察培养物的变化，确定最适宜的配方。除了用铅笔或油笔标记外，一个可行的办法，是在培养基中滴加1～3滴1％的活体染色剂，如亚甲兰、中性红、甲基紫等，将培养基染成不同的淡颜色，由于染色剂用量极微，不会对培养物产生影响，利用此法能够节约大量的时间。另外，甲基紫除供染色之外，还具有较强的杀菌作用，0.001％即可有效地抑制细菌和部分真菌的生长1.10抗生素的利用对于内生菌的情况，可使用抗生素类物质进行抑菌，经试验，甲基托布津、多菌灵、百菌清都有较好的效果，另据报道，链霉素、青霉素、地霉素、新霉素、夹竹桃霉素、抗菌肽等物质都具有降低内生菌污染的效果，可酌情试用。2几类常用培养基的特性自1937年White建立第一个植物组织培养的专用培养基以来，许多研究者报道了相当多的培养基配方，这些配方因其成分（主要是无机盐）水平的不同，可以大体划分成几类，并各具特点而适用于不同的培养目标。根据无机盐用量，培养基类型可以分为高盐型培养基，高KNO3型培养基，中盐型培养基，低盐型培养基。2.1高盐型培养基MS是使用最广泛的培养基。其特点是无机盐浓度高，养分齐全，铵态氮和硝态氮含量高，比例也比较适合，不需要添加更多的有机附加物，离子平衡情况较好，使用的误差较小。利于愈伤组织的诱导和增殖，能满足植物组织对矿质营养的要求，适用于高需肥量植物种类或生长迅速的培养材料。MS基本培养基的全部组份见243页附录4。与MS培养基较为接近的配方，还有LS（1965）和RM（1964），它们的基本成分均同于MS，但前者去掉了甘氨酸、烟酸和盐酸吡多醇，后者则把硝酸铵从1650mg.L-1升至4950mg.L-1，磷酸二氢钾从170mg.L-1升至510mg.L-1，成为一个极高盐的配方。可归入此类的配方还有BL，BM，ER和MT等2.2高KNO3型培养基对于喜钾、喜硝或忌铵的外植体材料而言，选用此类培养基是比较适宜的，此类配方有B5（1968）和N6（1974），前者的特点是铵盐较低，盐酸硫胺素较高，对枇杷胚状体的诱导效果较佳。后者由我国的朱至清等发明，高硝酸铵，不含钼，特别适用于禾谷类作物的花药培养，曾获国家发明二等奖，在国内外都有广泛的使用。2.3中盐型培养基中盐型培养基包括H（1967），Nitsch（1969）和Miller（1963）等，在离体培养中也有广泛的应用。2.4低盐型培养基低盐型培养基的特点是无机盐浓度低，适用于生根培养、成熟胚胎培养或种质材料的保存，包括White（1943），改良White（1963），HB（1963），WS（1966）和Knop（1965）等，其中Knop（1965）仅包括4种成分，可用作水培的培养液，改良White（1963）则比较多用于木本植物。3培养基的配制用于配制培养基的水最好是蒸馏水或双蒸水，所用的各种化学药品应尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂，以免杂质对培养物造成不利影响。药品的称量及定容都要准确，不同的化学药品需使用不同的药匙，避免药品的交叉污染与混杂。称量时应特别仔细，每称取一种药品都应随时记录称量情况(包括品名、重量等)，以免重复或弄错，又便于实验后分析。国内化学试剂的分级与缩写分级英文缩写标签颜色优级纯试剂GuaranteedreagentGR绿分析纯试剂AnalytialreagentAR红化学纯试剂ChemicalpureCP蓝实验试剂LaboratoryreagentLR中黄3.1母液配制及保存培养基的配制应遵循一定的方法程序。培养基母液：又叫贮备液，是在配制培养基时事先配好的浓缩液。培养基母液类型包括无机盐、维生素以及在水溶液中稳定的生长调节物质等一个常规的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，配成培养基配方使用浓度的10倍或100倍，甚至1000倍。平时贮存在2～4℃冰箱内，待配制培养基时取出，按比例稀释配用。这样每种药品称量一次，可以使用多次，并可减少多次称量所带来的误差。母液的配制有两种方法：一种是配制成单一化合物母液，一种是配成几种不同化合物的混合母液。前一种方法适合配制多种培养基都需要的同一种母液，后一种方法在大量配制同种培养基时省时省力。配好的母液应保存在棕色瓶中贮存以MS为例介绍培养基的制作方法该配方中除蔗糖和琼脂外，还包括有19种成分，1.核实试剂，计算。2.配制母液。为减少配制母液的工作量，可把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种无机盐时还应注意先后顺序，必须把CaCl2与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物，另外，Fe2+容易与某些阴离子如OH-结合形成沉淀而失效，故铁元素需单独配制成螯合铁母液。对于植物生长调节物质，配制成母液时，一般宜配制成0.5或1.0mg.mL-1的母液，这样的浓度既便于计算也可避免冷藏时形成结晶。由于多数生长调节物质难溶于水，因此配法各不相同。大体上，酸类物质（如生长素类和脱落酸）和苯基脲类物质可用少量的1mol.L-1NaOH溶解，蒸馏水定容，碱类物质（如腺嘌呤的衍生物）可用数滴1mol.L-1的HCl溶解，蒸馏水定容，GA3用95％酒精溶解及定容，玉米素可先溶于少量95％酒精中再加水定容。另外，IAA，IBA、NAA和2,4-D也可用95％酒精溶解，蒸馏水定容。所有的生长调节剂母液应贮于试剂瓶中，存放在冰箱内避光保存。植物生长调节物质浓度的表示有两种单位：以前常用ppm(或每升毫克数)，现状更提倡用mol.L-1，它们之间的换算方法见有关资料。3.贴标签。配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应吸取的量。母液最好在2～4℃3.2培养基的煮制配制培养基时先将贮存母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿、量筒、烧杯、移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。称量好所需的琼脂、蔗糖、蒸馏水，配好所需用的生长调节物质，准备好分装容器。先在烧杯或锅内放一定量的蒸馏水，加入琼脂和蔗糖并加热溶解，然后按母液顺序，根据不同母液的不同倍数吸取规定的量。加完所有的培养基组份（包括所需的生长调节物质）后，继续加温并不断搅拌，待琼脂完全溶化后定容3.3pH值的调整由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响；另外，培养基的pH值还影响琼脂的凝固。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸，但最好多用一两种试纸同时测定，免得一种pH试纸偏差太大而明显影响外植体的生长。培养基若偏酸时用lmol.L-1的NaOH来调节，偏碱则用1mol.L-1的HCl调节。一般将培养基的pH值调节到5.4～6.0。如果pH值高于6.0，培养基会变硬，pH值低于5.0，则不能很好地凝固。pH计/酸度计PH试纸3.4培养基的分装与灭菌配制好的培养基要趁热分装。一般以占试管、三角瓶等培养容器的1/5～1/4为宜。太多会浪费培养基，而且减少培养材料的生长空间；太少则会因营养不够而限制生长。当用试管制备琼脂固化培养基时，若是用于初代培养，最好把试管斜置，将培养基制成斜面，为外植体的接种提供一个较大的面积，便于观察生长效果。培养基分装后应立即进行热压灭菌处理。若不能及时灭菌，则应放入冰箱或冰柜中，在24h内完成灭菌工作高压灭菌锅的使用注意事项：1.消毒灭菌时，在压力表读数为1.1kg/cm-2或0.1Mpa，121℃2.在蒸汽灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排冷空气可用下列办法：事前打开灭菌锅放气阀，煮沸15min后再关闭或等大量热蒸气排出后再关闭；3.培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围，否则培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。4.当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。对于吲哚乙酸、玉米素及某些维生素等遇热不稳定的生物活性物质，不能进行高压蒸气灭菌，应改用过滤方法灭菌。通常采用减压过滤装置和过滤灭菌器，前者主要由过滤器和抽气系统两部分构成。但所有器皿事先均应高温蒸气灭菌3.5培养基的保存与使用培养基凝固后，将其放到培养室中2～3d，若没有杂菌污染即可放心使用。暂时不用的培养基应放置于10℃下保存，而含有生长调节物质的培养基在4～5℃生长调节剂配制过程先用有机溶剂或碱溶解,溶解后将生长调节剂溶液倒入水中,则不是反过来。例子：高浓度的NAA配制时，如果是将水倒入已溶解的NAA溶液中，容易导致已溶解的NAA沉淀含生长调节剂的培养基灭菌方法通常加入到培养基中再高温灭菌而活性不会明显丧失的有:2,4-D,NAA通常加入到培养基中再灭菌,但活性会部分丧失的有:ABA,BA,GA3,IAA,IBA,KT,TDZ,ZT通常只采用过滤除菌的有:CPPU脲类细胞分裂素,GA4,GA7,JA茉莉酸甲酯培养基母液的配制大量元素10倍母液：含NH4NO3,KNO3,MgSO4,KH2PO4,宜4C冰箱内贮藏，也可灭菌后室温贮藏微量元素1000倍母液,含H3BO3,ZnSO4,MnSO4,Na2MoO4,CuSO4,CoCl2。后3者取用量很少,称量困难,可以先配成10mg/ml的溶液,然后吸取所需量。该母液宜分装成1ml每管,贮于-20C,每次取1管配成1L培养基抗生素的配制不同抗生素用不同溶剂溶解，如用水溶解的有：Amp，Carb，Kan，Cef；用甲醇或乙醇溶解的有：Cm，Rif，Tet。抗生素一般配制成1000～10000倍母液，总浓度一般在100mg/ml以内，头孢霉素可达250mg/ml。抗生素用无菌水或有机溶剂配制后分装冰冻保存，不用灭菌。液体和固体培养基的配制液体培养基：先取适量水,再加各种母液(抗生素和某些植物激素在灭菌冷却后再加),每加一种后搅拌均匀,再称取适量蔗糖和少数其它试剂,溶解后调节pH,定容。固体培养基：在液体培养基调节pH值前加入琼脂或琼脂粉，加热溶解后调节pH值和定容。第四章离体培养基本技术

----外植体第一节外植体的类型及其选择与处理外植体是指用于接种培养的各种离体的植物材料，包括胚胎材料、各种器官、组织、细胞甚至原生质体等。也就是说，外植体是从植物体上取下的用于离体培养的材料，而不管该材料是植物体的哪一部分（大可以是胚胎、器官，小可以是细胞、甚至原生质体等）植物离体培养能否成功，既决定于培养基、培养条件等外在因素，也决定于外植体这一重要的内在因素。为了使外植体能在离体培养条件下存活与生长，必须对其进行细致的选择与处理，包括对供试植株的预处理、接种材料的制备和对材料的灭菌与切取等方面。同一植株的不同器官、组织或其它材料，以及植株的质量、年龄、生理状态、取材季节甚至天气状况等，都会直接或间接地影响离体操作和培养工作的成败，因此，为了提高离体培养工作的成效，必须根据外植体的类型和试验的目的进行必要的选择1.1外植体的类型及其优缺点—茎尖茎尖是园艺植物离体培养中应用最多的一类外植体，这是由它的形态结构特性决定的。茎尖在形态结构上是植物地上部分的雏形，具有顶端分生组织、叶原基和腋芽原基，只需诱导生根即可成为完整植株（狭义茎尖培养）。茎尖作外植体的特点是：1.材料来源广泛，操作简单，成株容易，变异少。2.采用茎尖进行离体培养，不但生长速度快，繁殖率高，而且不容易产生遗传变异，是最理想的起始材料之一。3.利用微茎尖进行离体培养，还是获得无病毒植物的一个有效途径，对园艺植物的科研与生产都具有十分重要的意义外植体的类型及其优缺点—

茎段、花茎或花梗（带节或不带节的材料）茎尖是较好的培养材料，但取材可能有限，特别是对假轴分枝型植物来讲，茎尖顶芽往往发育为花序，如月季、番茄、葡萄等植物，不注意观察会把花蕾当作茎尖取材，偏离研究的目标。因此，对这一类植物可采用带节的茎段进行培养，促使节位上的腋芽萌发，实现植株的再生。如果茎尖和带节茎段的取材都不能满足需要的话，也可采用不带节的茎段进行培养，但这样的茎段上不具有腋芽，须通过不定芽或胚状体的诱导来实现植株再生，多数情况下需经过脱分化阶段，其变异率会有所提高。茎段、花茎或花梗除此之外，在某些特殊的植物种类中，如果茎尖茎段都不能满足取材需要的话，还可以采用花茎或花梗这样的变态茎作为外植体，例如蝴蝶兰属于单茎性气生兰，植株上极少发育侧枝，一般只有一个茎尖，如果直接从开花植株切取茎尖或茎段，就会牺牲植株，而以花梗侧芽、花梗节间作为外植体，则能保住母株，而且成功率也比较高。1.1外植体的类型及其优缺点—叶片叶的培养最早是作为叶片形态建成研究的手段，随着离体培养技术的发展，也作为一种比较常用的外植体材料。A.优点：以叶片材料作为外植体，不但取材容易，操作方便，而且能够大幅度扩大外植体的来源，特别是对单子叶植物而言可以不损失亲本植株，故在某些植物上应用颇多。适于一些再生能力较强的植物种类。如番茄、芥蓝、花椰菜、玫瑰、海棠、大岩桐、倒挂金钟、矮牵牛、兰花、豆瓣绿等植物，都可采用叶片为起始材料。B.缺点：由于叶片的分化程度较高，一般需要通过诱导愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较高。另外，对那些再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体再生的难度相当大。1.1外植体的类型及其优缺点—花球、花蕾和花药

A.花球和花蕾花球和花蕾中含有较多的分生细胞，具有较强的再生能力，也是较好的外植体材料。由于花球和花蕾属于生殖器官，胚胎发生能力较强，一般可通过诱导胚状体的途径实现植株再生，但也有通过愈伤组织和不定芽成苗的报道，例如采用花椰菜的3mm直径的花球组织、西瓜的2mm直径的幼蕾作为外植体，都可经过愈伤组织再分化绿苗。需要注意的是，以花球和花蕾为外植体时，因其中含有单倍体的细胞，所诱导的愈伤组织和再生植株中可能有单倍体类型。B.花药用于单倍体植株的诱导。C花瓣幼胚、成熟胚、种子1）胚胎和种子本身就是一个结构完整的微小生命体，是完整植株的雏形，只要提供适宜的培养条件，一般能够直接生长发育成结构复杂的个体植株，其间不需要脱分化和再分化的过程。2）胚胎材料的另一特点，是具有较强的胚胎发生能力，特别是幼胚材料，由于胚性相当强，研究中通常用于胚状体的诱导，诱导率远高于其它种类的外植体。子叶、下胚轴子叶和下胚轴作为胚的一部分，基本上也具有胚胎材料的特点，其再生能力和胚胎发生能力较强，多数情况下能够直接诱导不定芽，其间不需要脱分化形成愈伤组织的过程，而且诱导率较高，遗传较稳定，因而被广泛应用于离体培养。外植体的选择依据—外植体的生理状态取材植株的生理状态对离体培养的影响极为重要。幼嫩、生理状态活跃的材料比较容易培养，而成熟衰老、生理活性衰弱、或者是处于休眠状态的材料则难以培养。一般而言，春天植物开始生长，芽膨大而鳞片未开裂时取材最为合适，南方的植物则以春季刚萌动的嫩芽或嫩梢为佳。一般情况下不提倡采用处于休眠状态的外植体材料（如休眠的枝条或种子），发育年龄对培养材料的形态发生能力有较大的影响。。一般地，下部的芽及其长成的枝条的再生能力较强，越往上越接近成年态甚至老年态，再生能力呈递减的趋势。因此，对于木本植物而言，随着年龄的增加，除茎尖以外，其它的所有芽的成年态性一般是越来越强，离体培养也越加困难，对于这样的情况，需要改用幼年态材料或是对成年态材料进行返幼处理，使其恢复幼态性后再行培养，才能提高成功的可能性。返幼处理的方式多种多样，包括选用根蘖苗材料，将成年态枝条嫁接于幼年实生苗上，将成年树从基部重截，促其萌发桩苗、低位苗或徒长枝后取材，或对成年态材料进行生长激素（多用赤霉素或细胞分裂素类）处理等。通过返幼或部分返幼处理后，材料的培养相对容易成功，但随之可能出现的一个后果，是再生植株的幼年期（包括营养期）也会延长，导致开花结果的时期延迟，这对于以收获果实和以观赏花器为目的的木本果树和木本花卉而言，是一个不利的方面，需要妥善处理。1.2外植体的选择依据—取材的季节取材季节的影响来自三个方面，一是不同的季节所提供的材料可能有所不同，如生殖器官材料只能在生殖生长阶段取材；二是不同季节中的天气情况可能影响外植体灭菌的效果，如在雨季取材往往导致较高的污染率；三是不同季节中材料的代谢情况有差异一个较好的方法，是将植株种植于在温室内，从温室植株上取材，能够最大限度地克服季节与气候的干扰。1.2外植体的选择依据—外植体的大小外植体大小也会影响材料的成活与生长情况。一般而言，外植体越小，接种的成活率就越低，较大的外植体有利于成活，但过大的外植体，又可能因难以彻底灭菌而增加污染。另一方面，在进行脱毒培养时，又要求外植体尽量的小，以提高脱毒的效率。因此，建立无菌材料时，采用的外植体大小，还应根据不同植物材料和培养目的而异，一般选取0.5～1.0cm的外植体为宜，但如果是胚胎培养或脱毒培养的外植体，则可小至0.5cm以下，最小至0.1mm。除上述因素外，取材时还应选择优良的基因型，并从健壮无病的植株上取材，2.1减少带菌的处理减少材料的初始带菌量是降低污染率的最有效的措施。最好是在长期晴朗的天气条件下取样、选择新萌发的幼芽或嫩梢、选择表面比较光滑的材料、对母株定期喷洒杀菌药剂、用纸袋或薄膜袋将枝条封套保护待其萌发新芽后取样、在室内采用水插促芽后采样，或是在温室植株上采样等，都可以大大减少初始带菌量。2.2消毒剂的杀伤力和材料对消毒剂的耐受力不同的消毒剂种类，因其渗透力和化学性质不同，对材料的杀伤力也不大相同。不同的外植体材料，因其大小、结构、幼嫩程度的不同，对同一种消毒剂的耐受力也不相同。在选择外植体材料时，则应优先考虑体积较大、带菌量较少、耐受力较强的类型。对于坚硬致密的外植体材料（如成熟种子），可采用渗透力强的消毒剂（如75％酒精）进行表面灭菌，然后用0.1％升汞处理数十分钟。外植体经消毒剂处理后，必须用无菌水洗去残存的消毒剂，否则其会对外植体造成长期的伤害，尤其是那些附着力强、难以洗去的消毒剂如升汞等，一定要清洗多次。某些植物（如兰花）的外植体除表面带菌外，由于组织结构的特殊性，其内部或浅表的组织也会带菌，称为“内生菌”，对于这一情况，可在培养基中添加一定浓度的广谱抗生素，抑制内生菌的繁殖，并通过多次继代培养逐渐消除。2.5切割与接种的技巧外植体的大小会影响成活率，故应将材料切分成适宜的大小后接种。如果用于消毒的外植体比较大，则应尽量切取其内部的组织进行接种，因为内部的组织一般是不带菌的。接种的方向也比较重要，茎尖、茎段应保持直立、先端向上接种，叶片材料可用插接，也可以平放于培养基表面，但平放时一般将叶背朝下，以利于对培养基的吸收。3褐变的防止褐变是植物离体培养中一个比较普遍发生的问题，外植体接种后，于伤口处发生褐化，产生褐色物质，不仅使培养基变褐，而且可能造成培养物死亡，或严重抑制外植体的脱分化和器官分化。因此，褐变问题已成为离体培养的三大难题之一（另两个问题是污染和玻璃化）。很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。当外植体被切割后，切口附近细胞中酶与底物的分隔被破坏，在有氧气存在的情况下，多酚氧化酶催化酚类物质氧化成褐色的醌类，醌类物质在酪氨酸酶的作用下，使外植体细胞中的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。3.2影响褐变的因素—基因型不同植物种类的褐变情况有很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变，这是因为木本植物中存在较多的酚类物质，而酚类的糖苷化合物，正是合成木质素、单宁和色素的前体物质。另一方面，即使是同种植物的不同类型或基因型，也因酚类物质含量和酚氧化酶活性上的差异，发生褐变的程度也有不同。例如，蕉类种质资源中，B组染色体组越多，茎尖褐变就越严重，繁殖成功率就越低；荔枝品种中，绿沙幼胚培养褐变严重，东刘1号则较轻。3.2影响褐变的因素—外植体的生理状态及发育年龄一般说来，随着年龄和组织木质化程度的增加，褐变会有所加强。例如，荔枝（怀枝）的实生幼苗基本上不会褐变，而成年结果树枝条的褐变则相当严重；另外，分化程度高的材料（如叶片）比分化程度低的材料（如茎尖）容易褐变；成熟度高的材料比幼嫩材料容易褐变。切割外植体时，伤口创面大、外植体体积小的材料较易褐变，在取材和切割时应注意。3.2影响褐变的因素—培养基组份的影响许多试验证明，液体培养基能有效地克服外植体的褐变，在液体培养基中加上滤纸桥，效果就更好。这是因为外植体溢出的有毒物质可以很快扩散到液体培养基中，从而减轻了对外植体的危害。培养基成分对褐变也有一定的影响，初代培养时，无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，加剧褐变，因此，适当降低无机盐浓度有利于减轻褐变。3.2影响褐变的因素—培养条件从田间自然光照下的植株上取材，接种后容易褐变，如果事先对母株或枝条遮光处理后再取材接种，则褐变可以减轻，这是因为在酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶