E玫瑰花环形成实验

E玫瑰花环形成实验

中山医学院免疫教研室2019-04ERosetteFormingCellTestE玫瑰花环形成实验 中山医学院免疫教研室ERosette1

掌握E花环形成的原理熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下E花环的形态熟悉磁珠分离的原理

实验目的

实验目的

2T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物质基础。它们在T细胞活化、增殖和分化等过程中起重要作用。TCR-CD3复合物参与T细胞的抗原识别和信号转导；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L等膜蛋白参与T细胞活化及T细胞与其它细胞间相互作用。CD4/CD8分子辅助TCR识别结合抗原，参与信号转导；根据CD4和CD8分子的表达将其分为CD4+T和CD8+T细胞。T细胞CD2CD3TCRCD8密度梯度离心法CD4T细胞表面分子T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物3依靠表面标记的分离方法

流式细胞术分离法：利用各种荧光素标记的表面标记特异性抗体，使不同表面标记的细胞结合上不同的荧光素，借助荧光活化细胞分选仪将各种细胞分离开来。

*

依靠表面标记的分离方法

*4

*

免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。磁珠(microbead)标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到*免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被5磁珠分离策略：一.阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出移出磁场后收集目的细胞CD4+T细胞分离柱CD4-T细胞磁珠分离策略：一.阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流6磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二.阴性分选磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二.阴性分选7成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子），能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，可在光学显微镜下观察计数。本法可用于分离外周血T细胞及检测T细胞的数量和比例。E花环分离法原理*

TTBSRBCCD2成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分8实验材料1.肝素抗凝血2.Hank’s液3.淋巴细胞分离液4.绵羊红细胞悬液 5.灭活小牛血清6.水平离心机、37℃温箱、显微镜等实验材料1.肝素抗凝血9实验方案取外周血绵羊红细胞淋巴细胞分离显微镜下观察+实验方案取外周血绵羊红细胞淋巴细胞分离显微镜下观察+10实验步骤淋巴细胞的分离用Hank’s液配成106细胞/0.1ml实验步骤淋巴细胞的分离用Hank’s液配成106细胞/0.111加等量灭活小牛血清(0.1ml)取0.1ml

加入0.5％绵羊红细胞0.2ml混匀，37℃温箱放置5分钟1000rpm离心5min加等量灭活小牛血清(0.1ml)取0.1ml 加入0.5％绵12加1小滴1％美蓝，用毛细吸管轻轻混匀取1滴于玻片上，加上盖玻片高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞置4℃冰箱5min30-45min加1小滴1％美蓝，用毛细吸管轻轻混匀取1滴于玻片上，加上盖玻13结果判断凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。正常人的花环形成率50-70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。结果判断凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。14左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。

T淋巴细胞玫瑰花环左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫15T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500×T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500×16E玫瑰花环形成实验17测定外周血中的T细胞数，观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等。临床应用临床应用18注意事项1.实验血液新鲜分离:是为了保证淋巴细胞的活性,不影响E玫瑰花环形成率。2.绵羊红细胞要新鲜,采用无菌脱纤维羊血。注意事项1.实验血液新鲜分离:是为了保证淋巴细胞的活19Thanks!Thanks!20E玫瑰花环形成实验

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掌握E花环形成的原理熟悉E花环形成实验的步骤及光镜下E花环的形态熟悉磁珠分离的原理

实验目的

实验目的

22T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物质基础。它们在T细胞活化、增殖和分化等过程中起重要作用。TCR-CD3复合物参与T细胞的抗原识别和信号转导；CD2、CD28、CTLA-4、CD45、CD40L等膜蛋白参与T细胞活化及T细胞与其它细胞间相互作用。CD4/CD8分子辅助TCR识别结合抗原，参与信号转导；根据CD4和CD8分子的表达将其分为CD4+T和CD8+T细胞。T细胞CD2CD3TCRCD8密度梯度离心法CD4T细胞表面分子T细胞的表面分子是T细胞与其它细胞和分子间相互识别及作用的物23依靠表面标记的分离方法

流式细胞术分离法：利用各种荧光素标记的表面标记特异性抗体，使不同表面标记的细胞结合上不同的荧光素，借助荧光活化细胞分选仪将各种细胞分离开来。

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依靠表面标记的分离方法

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免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。磁珠(microbead)标记细胞上的磁珠在扫描电镜下也几乎看不到*免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被25磁珠分离策略：一.阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出移出磁场后收集目的细胞CD4+T细胞分离柱CD4-T细胞磁珠分离策略：一.阳性分选磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流26磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二.阴性分选磁珠标记非目的细胞目的细胞先行流出二.阴性分选27成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分子），能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，可在光学显微镜下观察计数。本法可用于分离外周血T细胞及检测T细胞的数量和比例。E花环分离法原理*

TTBSRBCCD2成熟的人T细胞表面表达绵羊红细胞（SRBC）受体（即CD2分28实验材料1.肝素抗凝血2.Hank’s液3.淋巴细胞分离液4.绵羊红细胞悬液 5.灭活小牛血清6.水平离心机、37℃温箱、显微镜等实验材料1.肝素抗凝血29实验方案取外周血绵羊红细胞淋巴细胞分离显微镜下观察+实验方案取外周血绵羊红细胞淋巴细胞分离显微镜下观察+30实验步骤淋巴细胞的分离用Hank’s液配成106细胞/0.1ml实验步骤淋巴细胞的分离用Hank’s液配成106细胞/0.131加等量灭活小牛血清(0.1ml)取0.1ml

加入0.5％绵羊红细胞0.2ml混匀，37℃温箱放置5分钟1000rpm离心5min加等量灭活小牛血清(0.1ml)取0.1ml 加入0.5％绵32加1小滴1％美蓝，用毛细吸管轻轻混匀取1滴于玻片上，加上盖玻片高倍镜下观察玫瑰花环形成细胞置4℃冰箱5min30-45min加1小滴1％美蓝，用毛细吸管轻轻混匀取1滴于玻片上，加上盖玻33结果判断凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。正常人的花环形成率50-70%，大致可以代表周围血中T细胞的百分数。结果判断凡能结合三个以上绵羊红细胞者为玫瑰花形成阳性细胞。34左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫瑰环的T淋巴细胞；右:（吖啶橙染色）：图中可见3个染成橙黄色荧光的T淋巴细胞被绵羊红细胞所包围。

T淋巴细胞玫瑰花环左:（甲紫染色，800×）：可见2个被绵羊红细胞包围而形成玫35T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500×T淋巴细胞玫瑰花环扫描电镜，6500×36E玫瑰花环形成实验37测定外周血中的T