外源基因表达调控1课件

第三部分外源基因在转基因植物细胞内的表达调控引言表达调控的研究内容起始密码边周序列（initialcode）翻译增强因子（Ω

）密码剂量效应(codonbias)

启动子活性（promoter）增强子（enhancer）Poly(A)信号(signal)内含子（intron）不稳定因子隐含内含子序列隐含Poly(A)信号外源基因在不同水平上的表达调控整合状态基因活性调控水平DNA水平RNA水平蛋白质水平转录效率转录加工mRNA稳定性翻译效率翻译后修饰蛋白质运输整合位置效应（positioneffect）拷贝数影响（copiesnumbers）DNA再分布（DNArearrange）DNA甲基化（DNAmethylation）共抑制和反式失活（cosuppression&trans-inactivity）剪切内含子-1叶绿体线粒体核糖基化信号肽第三部分外源基因在转基因植物细胞内的表达调控一.转化外源基因的瞬时表达和稳定表达1.瞬时表达

概念过程2.瞬时表达的机理

a.瞬时表达是没有整合的外源基因的表达

b.瞬时表达是一种正常的表达方式3.外源基因瞬时表达的影响因素 （1）质粒DNA的结构 （2）内源核酸酶的影响 （3）受体细胞生理状态 (4)内源GUS酶抑制剂4.外源基因瞬时表达的应用 （1）在基因转化研究中的应用

a.农杆菌转化能力的检测

b.优化基因转化条件 （2）植物基因表达调控的研究5.外源基因的稳定表达 外源基因在植物细胞中的稳定表达的条件

a.时间长 b.无迅速衰退现象

c.分子杂交证明DNA已经整合到植物基因组中

d.能遗传，并符合分离规律第三部分外源基因在转基因植物细胞内的表达调控一.转化外源基因的瞬时表达和稳定表达二.转化外源基因的同源性和异源性表达异源性表达（heterologousexpression)同源性表达（homologousexpression)

异源性表达只是基因编码序列“异源”，而启动子和其它调控序列必须与植物同源二.转化外源基因的同源性和异源性表达2.原核生物基因在植物细胞中的表达

原核与真核基因在表达机制上有很大的差异，因此细菌的基因直接导入植物细胞是不能表达的。即使采用了植物基因的表达调控系统，没有改造的细菌基因也只能很低水平的表达。例：Bt.δ-毒蛋白抗虫基因表达量仅占植物可溶蛋白总量的0.001%达不到抗虫的目的。原因是，mRNA结构中可能隐含有polyA信号AAUAA序列及内含子切割序列等，从而造成mRNA在不适当的位置上断裂而降解。向植物中引入Bt基因的改造。在不改变氨基酸序列的情况下，改变了20%的碱基序列，提高了GC含量，使其在植物中的表达由原来的0.001%提高到0.05~0.1%（提高了50-100倍）。抗虫效果明显提高。向植物中引入Bt基因的改造修饰原则：1.优先使用植物偏爱的密码子2.改变基因的GC含量（36~45%），使之与植物基因GC含量一致3.注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。对植物而言，该比值低好。Thr,Pro,Ala和Ser密码子第三位避免用G。4.翻译起始区第4个核苷酸用G，以符合ATGGC的要求。5.去除隐含的poly（A）信号。如：AATAA，AATGAA，AATAAT，AATATT，GATAAA，GATAAG6.去除隐含的RNA聚合酶II终止序列。CAN1~9AGTNNAA7.清除发夹环结构。CUUCGG8.消除隐含的内含子剪切序列。AAG.GTAAGT等

10三.转录调控序列对外源基因表达的影响1.高等植物基因的分子结构特点2.5’-端表达调控序列的基本特征

启动子Promoter

增强子Enhancer

沉默子Silencer

顺式作用元件Cis-acting-element

反式作用因子Trans-acting-factor 启动子 确保转录精确而有效地起始的DNA序列

TATAbox–25~-35负责转录起始的精确性 CAATbox GCbox–80~-110控制转录起始频率

多数组成型启动子上游有（hexamermotif)TGACTG

可诱导启动子中常有CCACGTGG8核苷酸G-box植物转录起始位点处的保守序列:YYYAYYA+1三.转录调控序列对外源基因表达的影响3.启动子和增强子

增强子的作用是增强RNA的转录效率，其功能是通过结合特定的转录因子或影响DNA的构象而实现的。增强子作用的三个特点： 1.它与启动子的相对位置和取向无关，具有远程效应 2.需要特定的蛋白质因子的参与 3.有些（如SV40的增强子)能在几乎所有类型细胞中发挥 作用，而大多数具有相对的组织特异性目前已分离的大量的启动子（包括增强子）按其作用方式大体可划分为三类组成型 诱导型 组织特异型三.转录调控序列对外源基因表达的影响3.启动子和增强子（1）组成型启动子

A.CaMV35S启动子CaMV35S启动子二.转录调控序列对外源基因表达的影响3.启动子和增强子（1）组成型启动子

A.CaMV35S启动子

B.NOS启动子组成型,损伤,激素诱导活性,-123--114之间或重叠区有20ntZ-DNA形成因子可以与bZIP蛋白因子相互作用,诱导活性必需序列.启动子的强度依组织部位及器官位置而变化,老组织中强,生殖器官中随发育状态而不同.在禾本科植物中完全或几乎无启动子表达能力.

TGACGTAAGCACATACGTCA-123~114Z-DNA三.转录调控序列对外源基因表达的影响3.启动子和增强子（1）组成型启动子35SP-750TGACGTProtein-leucinezipper(trans-actingfactor)NOSPfgfhcdgfghjkhhjh二.转录调控序列对外源基因表达的影响3.启动子和增强子（1）组成型启动子

A.CaMV35S启动子

B.NOS启动子C.玉米的Ubiquitin和水稻Actin1启动子同一启动子在不同的受体细胞内的调控表达水平的能力有很大差别,如35S启动子在禾本科中是双子叶植物的1-10%.NOS启动子在禾本科植物细胞内几乎没有活性根据试验目的,往往需要外源基因以不同的强度表达.组成型启动子

不同启动子的相对强度(2`-Npt-II活性为100,pGVLl150为对照)嵌合基因结构启动子来源水稻悬浮系水稻叶烟草叶2`-Npt-IIT-DNA10010010035S-Npt-IICaMV40±4ND28±1Nos-