苜蓿中总黄酮提取工艺的优化-应用化学毕业设计

毕业设计题目名称苜蓿中总黄酮提取工艺的优化学院文理学院专业/班级应用化学11101学生XX学号XX指导教师XXXXxx理工学院毕业论文xx理工学院毕业论文毕业设计任务书题 目苜蓿中总黄酮提取工艺的优化专 业 应用化学 学生姓名 xx 班级学号 xx 指导教师 xx 指导单位文理学院化学工程系专业负责人 xx 日 期 2014.10.30

毕业设计（论文）题目苜蓿中总黄酮提取工艺的优化题目类型科研类 题目来源 实验毕业设计（论文）内容与技术要求一、 内容：1、综述2、 实验准备3、 单因素考察4、 设计正交试验5、 稳定性测试二、 技术要求：通过对不冋条件下提取黄酮量的大小，找出最佳提取参数，设计止交试验，获取最佳提取工艺毕业设计（论文）进度第一阶段（2014年8月-2014年10月）：文献查询第二阶段（2014年10月-2014年11月）：原料的预处理，准备实验第三阶段（2014年11月-2015年1月）：单因素考察第四阶段（2015年1月-2015年2月）：正交试验的设计第五阶段（2015年2月-2015年3月）：进行正交试验和稳定性测试第六阶段（2015年3月-2015年4月）：撰写论文的初稿第七阶段（2015年4月-2015年5月）：论文定稿，制作 PPT准备答辩第八阶段（2015年5月-2015年6月）：论文答辩参考资料高微微，何春年，佟建明•我国苜蓿属植物资源及应用概况 [J].时珍国医国药,2006,17（5）:680-683.赵祥.苜蓿产业化生产与加工利用 [M].山西：金盾出版社，2002,1-5.曹致中.优质苜蓿栽培与利用[M].北京：中国农业出版社，2002,1-11.耿华珠.中国苜蓿[M].北京：中国农业出版社，1995,1-10.El-KhrisyEAM,AbdelHOM,KhattabA,eta1.ChemicalconstituentsofMedicagosativaL[J].Bu11.Natl.Res.Cent,1994,19（2）:117-122.何春年，高微微，佟建明.苜蓿属植物的皂苷类化学成分 [J].中国农业学报,2005,21（3）:107-108.王东冬.大豆皂苷的提取纯化与分离检测 [D].上海:上海交通大学,2006.注：1•课题类型：工程设计、技术开发、软件工程、理论研究和方法应用、管理模式设计等2•课题来源：教学、科研、生产、实验、其他xx理工学院毕业论文xx理工学院毕业论文第1章文献综述1.1概述苜蓿在我国的发展已经有2000多年的历史了，因其产草量高、富含蛋白质、适口性好，适应性强等特点而被广泛种植，素有 牧草之王”的美誉⑴。1.1.1苜蓿的性状苜蓿是多年生宿根草本，主根长2米左右，根茎发达，多有蔓茎，其上有豆科植物的固氮小球。茎高25-80厘米左右，有直立或匍匐生长，枝上多光滑，有分叉，叉多。叶子多为三瓣，也有少数四瓣，叶片多椭圆形，长 2-4厘米左右，有的叶片上部尖端有锯齿，有的叶片顶端中间突出；叶柄长且平滑，有托叶。花梗由叶腋长出，花有3-5厘米左右的短柄；成簇状花，其中有10-30朵不等的紫色或白色小花；花多细长，有齿；花冠紫色居多。荚果圆形，长有毛，灰褐色，不开裂。种子多4-8粒，椭形，黄褐色，很小。花期长，大约为2周左右。目前紫花苜蓿有野生和栽培两种生长方式， 分布很广。通常研究的都是干苜蓿，以其叶、枝、花、果实、根等不同部位分开或一起粉碎成不同目数来研究。图1.1原料苜蓿预处理流图1.1.2苜蓿的发展及分布苜蓿起源于伊朗等地，汉武帝时期开始引入中国。由于其良好的特性而被广泛应用于饮食、畜牧、中药和肥田改土等方面⑵。苜蓿可以防出血，清内热；历史上记载苜蓿的书籍有很多，如：《本草纲目》对苜蓿描述如下： 安中利入，可久食，利五脏、轻身健人，洗去脾胃间邪热之气，通小肠诸恶热毒 ”］。曹致中⑷、耿华珠⑸等人对苜蓿的分类、生长环境、成分含量等做了深入的研究；紫花苜蓿在新疆、甘肃、宁夏等14个省市自治区均有分布，我国苜蓿种植面积已达到2000多万亩，年干草产量达到2000多万吨。50年代宁夏种植苜蓿的面积

为1.7万公顷，后来不断扩大，到了80年代种植面积已经达到了14万公顷。苜蓿的种植面积是不断增大的，但是开发利用却主要集中在饲料价值和干草加工技术方面，对其生物活性方面研究很少，产品的经济附加值较低。1.1.3苜蓿中的营养成分苜蓿中的营养成分主要有皂苷类、黄酮类、生物碱、膳食纤维、多糖类、叶蛋白类、维生素E、香豆素类和有机酸类等⑹。另外，苜蓿中还含有多种挥发油、氨基酸、维生素、类胡萝卜素、微量元素等成分⑺。苜蓿中的黄酮类化合物，能有效清除人体自由基⑹，防止肾上腺素氧化，且有轻度雌激素样的作用，而且对畜禽有明显的促生长、提高繁殖力和增强机体免疫力、护肤和美容 ⑺等作用。本文主要研究黄酮类化合物，在第二节将对其详细介绍。从苜蓿中可以分离出43种皂苷类化学成分，主要结构特征为：齐墩果烷型五环三萜［9］如图1.2的1这些皂苷类化合物又名皂素、皂甙、皂角苷，普遍存在于植物体内，是重要生物活性天然次生代谢产物；能与水混合并搅拌后产生泡沫［10］。皂苷由皂苷配基与苜蓿苷酸等其他有机酸组成如图 1.2的2［11］。皂苷大多分布在百合科、五加科、豆科等植物中，海洋生物如海参也有少量皂苷类化合物；人参、桔梗、甘草、柴胡等中草药的主要有效成分之一就是皂苷 ［12］。皂苷的主要结构是以常春藤皂苷元如图1.2的3、大豆皂醇如图1.2的4等为母核［13］。RR76134图1.2部分皂苷类化合物的主要成分苜蓿多糖是紫花苜蓿自孕蕾期从茎、叶中提取的水溶性苜蓿多糖，是非淀粉多糖，浅黄色粉末，易溶于水，不溶于 80%乙醇，性质稳定［14］。苜蓿中的糖类是具有生物活性的多糖之一，它对畜禽有明显的促进生长作用，能增强免疫功能和抗感染，强化血管和降血糖，抗辐射和心肌梗塞等 ［15］。刘晓峰［⑹等人采用热水浸提法提取紫花苜蓿中多糖，并通过单因素试验和正交试验研究了浸提时间、浸提温度、浸提固液比、浸提次数对提取紫花苜蓿中多糖得率的影响。 得到紫花苜蓿中提取多糖的最佳提取工艺条件为浸提时间 1h、浸提温度95C、固液比1：30、浸提3次。在该最佳提取条件下，多糖的得率可达 6.1%。紫花苜蓿中的生物碱结构较简单，为氨基酸类衍生物。从紫花苜蓿中可以分离出的生物碱有N-丙二酸单酰基色氨酸、高水苏碱和水苏碱等。主要结构有吲哚环、吡啶环和毗咯环如图1.3［17］。H图1.3部分紫花苜蓿中的生物碱1.2黄酮类化合物结构及理化性质目前，已报道的黄酮类化合物超过4000种。紫花苜蓿中可以分离出53种黄酮类化合物。这些黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。根据这些结构特点，可将黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、双苯吡酮类、查尔酮和双黄酮类等十五种。1.2.1黄酮类化合物的结构黄酮类化合物又称生物类黄酮，是指具有a或3-5苯基吡喃酮的一大类物质［18］，其特点是具有C6-C3-C6的基本骨架如图1.4。通常认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。黄酮类化合物种类丰富，结构多样；其主要原因是C6-C3-C6的骨架上有多个可取代位置，具有较强结构修饰活力，而分子中存在的氧代糖苷、羟基、碳代糖苷、苯并吡喃基（疏水基）、香叶基等取代基大大丰富了该类化合物的生物活性 ［19］。紫花苜蓿中可以分离出多种黄酮类化合物， 如黄酮及其苷类，黄酮醇及其苷类、异黄酮类、异黄烷类、二氢黄酮类、紫檀烷类等结构类型；各类黄酮化合物的母核主要有芹菜素、苜蓿素、槲皮素、山萘酚、维斯体素、蒜头素、花色素等，其中芹菜素、苜蓿素、木樨草素最常见［20］（图1.5）。

查尔酮类 黄酮类C6-C3-C6骨架查尔酮类 黄酮类C6-C3-C6骨架2-苯基色原酮色原酮图1.4部分黄酮类分子的结构苜蓿素能有效清除人体内的自由基，抗氧化、降血脂，预防心脑血管疾病。从苜蓿中提取的大豆黄酮、苜蓿素有抗氧化作用，可防止肾上腺素的氧化，并有轻度雌激素样作用和抗癌作用[21]0苜蓿素HO芹菜素OH花色素苜蓿素HO芹菜素OH花色素图1.5紫花苜蓿中部分黄酮类化合物的母核结构1.2.2黄酮类化合物的理化性质大多数黄酮类化合物多是含有结晶水的固体，其中黄酮苷类多为无定型粉末[22]。黄酮类化合物的理化性质主要体现在溶解性、旋光性、酸碱性和显色反应等方面。溶解性：黄酮类化合物的溶解性因其不同的结构和存在状态而异， 一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于乙醇，乙醚等有机溶剂和稀碱溶液中；其中黄酮、黄酮醇、查耳酮因分子与分子间堆砌较紧密，分子间引力较大，故更难溶于水；而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面性分子，故排列不紧密，分子间引力降低，有利于水分子进入，溶解度稍大（如图1.6）0黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中。花色苷元类虽也为平面性结构，但因以离子形式存在，具有盐的通性，故亲水性较强，水中溶解度较大。黄酮类化合物的轻基糖营化后，水溶度即相应加大，而在有机溶剂中的溶解度则相应减小。糖链越长，则水溶度越大。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂中图1.6二氢黄酮及二氢黄酮醇的非平面分子酸碱性：黄酮类化合物分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。因有未共用的电子对，故表现微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，当强酸过量时会溶解生成钅 羊盐。旋光性：游离的苷元除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外大多无光学活性，只有混入糖分子时大多才显示左旋性。显色反应：黄酮类化合物的显色反应多与分子中的酚羟基及 r-吡喃酮环有关，显色反应结果可以定性地判断黄酮类化合物的存在及它们之间的区别 ［23］。当黄酮遇盐酸和锌粉会变红，黄酮醇则会变紫红，二氯黄酮变紫红；遇醋酸镁，黄酮、黄酮醇和二氯黄酮都会变成黄色并带有银光；遇三氯化铝，黄酮会变黄，黄酮醇变黄绿，二氯黄酮变蓝绿，查尔酮和异黄酮会变黄，橙酮则会变浅黄。这些显色反应无疑是前期研究黄酮类化合物重要的标志之一。1.3黄酮类化合物的生物活性黄酮类化合物的生物活性主要体现在抗氧化、 抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等方面。60年代末，人们发现黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。到了70年代，又发现其在抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤作用方面有作用。黄酮类化合物的生理活性是多种多样的，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌，降血糖，抗氧化，抗辐射，抗癌，抗肿瘤以及增强免疫能力等作用。1.3.1抗氧化及消除自由基的作用1996年胡春［24］对黄酮类化合物防止脂质氧化的可能性进行了探讨，特别是对抗氧化作用与黄酮类合物结构间的关系上进行了讨论，得到黄酮类化合物具有不容忽视的抗氧化能力，对于一些因氧自由基损伤所引起的疾病可能有治疗价值，对含脂食品的自动氧化的防止有一定的实用价值， 是一类值得深入研究的天然产物。2000年黄池宝［25］等人对黄酮类化合物抗氧化性（图1.7）及结构进行了

研究，得出B-4-0H抗氧化活性强于B环其它羟基基团；C-3-0H无抗氧化性活性；双键的有无对抗氧化性无异。2008年候滨滨［26］对金莲花中黄酮类化合物提纯及抗氧化性进行了研究，得出提取物对花生油的抗氧化能力随添加量的增大而增大，而且精致产品的抗氧化性明显强于未精致产品的抗氧化效果。 2012年方玉梅［27］对金针菇黄酮类化合物抗氧化性的作用做了研究，得出随着金针菇黄酮类化合物浓度的提高其抗氧化作用也逐渐增强， 并在一定范围内黄酮类化合物与抑制率呈正相关。可见：提取物浓度是影响黄酮类化合物提取量的主要原因。 苜蓿总黄酮具有降血脂、降低低密度脂蛋白胆固醇、预防和减缓动脉硬化的作用，同时还具有抑制氧自由基损伤防止脂质过氧化的作用。黄酮类化合物抗氧化及消除自由基的机理主要分为两个部分：一是络合那些具有氧化作用的金属离子，形成鳌合物，从而降低金属的氧化作用；二是能和自由基进行反应，从而消除某些自由基的氧化作用OMeOMeOHOHHOOMeOMeOHOHHO图1.7部分抗氧化黄酮类化合物的结构式1.3.2抗肿瘤、抗癌活性2005年Ko［28］等人通过对36种黄酮类化合物的研究发现：Myricetin对抑制金属蛋白酶（MMP-2）的抑制能力最强，如图1.8的5;其机制与抑制PKC转位、ERK磷酸化、TPA诱导的MMP-2活性有关。2006年Quercetin^等人研究到图1.8的6是硫氧还原蛋白的抑制剂，对该没的IC50值为0.79umol/L,可使细胞生长周期停止在S期，细胞聚集在sub-GI期进而发生凋谢。2008年杨博［30］等人在黄酮类化合物的抗肿瘤作用机制研究进展中得到：黄酮类化合物的抗肿瘤靶点为周期依赖性激酶、硫氧还蛋白还原酶、基质金属蛋白酶等；其中周期依赖性激酶（CDK）比作细胞周期控的发动机，CDK可推进细胞周期的运行，有效阻止癌细胞的周期进程；有此作用机制的黄酮类化合物有 flavopiridol，如图1.8

的7、P276-00,如图1.8的8、Acacetin,如图1.8的9。水果、蔬菜、中草药等植物中含有丰富的天然黄酮类化合物，部分天然黄酮类化合物具有抗肿瘤活性和抗癌活性，其机理为部分黄酮类化合物阻滞了肿瘤细胞和癌细胞的增殖周期， 激活了内源性DNA内切酶，诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到抗癌的作用。这种 DNA内切酶一般是芳烃化酶，其活性作用可以对抗自由基或直接抑制癌细胞生长， 也可对抗致癌促癌因子起到抗癌的作用；黄酮类化合物可以抑制肿瘤细胞增值，导致肿瘤细胞死亡，且对正常细胞毒副作用较小。5OHOH6图1.8部分抗癌活性的黄酮类化合物的结构5OHOH6图1.8部分抗癌活性的黄酮类化合物的结构133抗炎、抗过敏大多黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏是的作用，而炎症、过敏反应的发生与体内的T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞密切相关。黄酮类主要通过影响分泌过程、有丝分裂及细胞间的相互作用而起效，多数黄酮可减少杀伤性 T细胞产生等。KuwanonC如图1.9的10，表现出适度的抑制活动对COX-2，其IC50值大于73.0卩M/mL当IC50值为19卩M/mL时kuwanonC显示温和抑制12-LOX的活性［31］。化合物如图1.9的11,是从桑干树皮中分离得到的，具有有效的抗炎活性，通过抑制大鼠中性

粒细胞葡萄糖醛酸酶-B释放活性从而诱导血小板活化因子，其 IC50值为10-5mol/L时抑制率为93.6%［32］。从白毛藤中分离的lyratinB如图1.9的12,和lyratinC如图1.9的13,通过对大鼠白细胞中的当IC50C如图1.9的13,通过对大鼠白细胞中的当IC50值为10mm/mL时抑制率范围在禺葡萄糖醛酸酶显示出体外抗炎活性,OH图1.9部分抗炎活性黄酮类化合物的结构1.3.4抗菌、抗病毒作用黄酮类化合物抗菌抗病毒作用己经得到医药界的肯定， 这方面进行的研究较多，如黄苓苷、杨梅黄酮等均有抗病原微生物和抗病毒的作用， 微量的黄苓素对HIV逆转录酶有抑制作用［34］。二异戊烯基黄酮类化合物styracifolinA如图1.10的14和styracifolinB如图1.10的15分离于桑树的树皮对人肿瘤细胞枯否氏细胞（NFkB）和人成纤维细胞系（MRC-5）具有细胞毒性，化合物（1）表现出较强的抵抗活性，两个细胞系的IC50值分别为5.6卩M/m!和4.7卩M/mL化合物（2）表现对细胞相对温和的活性，其IC50值为27.2卩M/m和31.7卩M/卅3?1515图1.10部分抗毒活性黄酮类化合物的结构135抗疟原虫的活性疟疾是最危险的感染疾病之一，治疗疟疾的首选药物是复方青蒿素类药剂。由于个体身体与生存环境的差异系， 对这种药物的抗性也各不相同；因此新药物的开发就显得很必要了。abyssinoneV如图1.11，是2012年YenesewaAA6］从刺桐根皮和茎叶中分离的黄酮类化合物；当 IC50（英文为：halfmaximalinhibitoryconcentration,是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度；其可以衡量药物诱导凋亡的能力，诱导能力越强该数值越低。）值为0.97±0.2卩g/mL1.73±0.5卩g时刺桐的丙酮的粗提取物在体外对D6和W2疟原虫具有显著抗疟原虫的活动；分离纯化后对黄酮类化合物测试发现，当IC50值为5-7卩M/mL寸abyssinoneV在体外是最有效的抑制D6和W2疟原虫，它与干草黄酮的活性（licochalconeA）相媲美（IC50为5.6±0.6卩M/mL经检测粗提物的抑制活性比任何分离的纯化的化合物要强，可能是粗提取物中含有多种化合物的共同作用所导致的。 可见黄酮类化合物中还有未被分离出来抗疟疾分子在起着作用。abyssinoneV图1.11具有抗疟原虫活性黄烷酮类化合物1.3.6黄酮类化合物的其它活性酶的抑制作用，黄酮类化合物对多种酶有抑制作用，如脱氧酶、磷酸二醋酶、环氧化酶、芳香酶、单胺氧化酶、醛糖还原酶等。 1978年第一次报道了黄酮类化合物能抑制磷酸二酷酶，该类物质对不同组织及细胞中的磷酸二醋酶有选择性抑止作用，且黄酮黄酮苷元强于黄酮苷；黄酮类化合物发挥抗炎、抗过敏、抗血栓及强心等生物作用与这些酶的抑制作用密切相关［37］。抗心脑血管疾病的作用，部分黄酮类化合物可治疗心脑血管系统的一些疾病，有降血脂、胆固醇、抑制血栓和扩张冠状动脉等作用，可用于治疗高血压、动脉硬化。在临床中主要表现在保护心肌缺血引起的心功能紊乱，增加冠状动脉血流及颈动脉流量、抗心肌及脑缺血，防止血栓形成和抗血小板聚集，对脑部血流循环及脑细胞代谢有改善和促进作用，降低血甘油三脂和提高高密度脂蛋白的含量。黄酮类化合物中最早发现的降压药是芦丁， 以后又陆续发现漆黄素、桑色素等，木犀草素都是有效的降压药，另外槲皮素、葛根素、山奈酚、黄苓素、儿茶素，和金雀异黄素等都对心脑血管疾病起作用。毒性，黄酮类化合物生理活性不同但却有共同的毒副作用， 如过敏反应、热原反应，甚至引起休克、死亡的病例屡有报道；在临床应用中引起毒副作用的主要原因是黄酮类化合物为交叉的共轭体系，由于电子转移与重排易形成 佯盐［38］。带有正、负电荷的碳正离子，与蛋白质的负、正电荷形成双对电荷复合物，该电荷复合物结合的非常牢固，用传统的分离方法很难除净，这就相当于药物中难以除去的杂质，影响了药效。对雌激素作用，苜蓿中的雌激素作用是与其所含的异黄酮化合物有关。异黄酮化合物结合到雌二醇激素受体上，促进细胞增殖及相关蛋白的表达，从而发挥雌激素样作用，可以作为辅助治疗用于低雌激素状况，预防和治疗骨质疏松。苜蓿中含有3种主要的植物雌激素：香豆雌酚，染料木黄酮和刺芒柄花素； 2种次要的为：大豆黄酮和鹰嘴豆素。此外，苜稽中的植物雌激素不仅具有激素活性，还有抗雌激素活性。在高雌激素的作用下，这些相对活性较弱的植物雌激素可以竞争受体结合位点，导致高活性的雌激素结合的有效受体位点的减少， 雌激素作用降低。对用于雌激素过多引起的经前期综合征， 乳房纤维囊肿，雌激素依赖性乳腺和子宫癌都很有意义［39］。此外，还有吸收紫外辖射、止咳、祛痰、提高记忆力、抗过敏、利胆及肝脏保护作用，治疗糖尿病等功效。黄酮类化合物的生物活性作用非常广泛，由于物种的差异性，在不同类物质中黄酮的含量也有差别，作用也各不同。可见，随着社会的发展，黄酮类化合物的也将与人们的生活密切的联系起来。1.4黄酮类化合物的提取、分离工艺目前，从苜蓿中提取黄酮类化合物的方法有很多种，每种方法各有利弊，以下是一些常用的提取方法。1.4.1热水提取法2006年戴伟锋［40］等研究了鱼腥草中总黄酮的不同提取方法，并通过正交实验确定了最佳提取工艺条件为水提法，固液比 1:40,提取时间45分钟，提取温度90C,提取次数3次；同年，盛萍［41］等采用紫外分光光度外法测定总黄酮含量，并且利用正交实验法对影响罗布麻提取效果的因素进行了研究， 确定采用煎煮法总黄酮得率最高，最佳方法为用药材 10倍量的水，煎煮3次，每次30分钟。2011年周萍芳［42］等人用水提法优化苜蓿黄酮的提取工艺，得到在不同的提取温度、提取时间和溶剂体积的条件下，对苜蓿总黄酮进行提取结果表明：水提法的最佳工艺为提取温度90C，提取时间4h，固液比1:40,该条件下苜蓿总黄酮的提取率为5.862mg/g。可见，提取温度、提取时间对提取总黄酮的量是不容忽视的。考虑到其水溶性，所以方法仅限于提取黄酮苷类化合物，在提取中通常对浸泡时间，加水量，回流时间，提取次数等因素做分析。热水提法有工艺成本低、安全、简单等特点，适用于工业化生产，可以被推广开来；但由于其提取液中杂质多、收率低、提取液浓缩过滤较难等缺点，而使用受限。有望通过添加催化剂等改善次工艺。1.4.2醇提法2003年许勇［43］等采用正交实验法，以补骨脂提取液中总黄酮含量为考查指标，对影响总黄酮提取工艺的因素进行了研究。 结果乙醇浓度有显著影响，最佳提取工艺为10倍量21mol/L,乙醇回流3次，每次2小时。2005年杨武亮［44］等比较枳壳原药材中黄酮的提取方法，采用HPLC法分别测定超声波法、回流法、索氏提取法提取的枳壳中柚皮苷和新橙皮苷的百分含量；结果直接回流提取法的提取液中，柚皮苷和新橙皮苷的提取率高，提取时间较短，操作简便，可作为枳壳原药材中黄酮成分含量测定的提取方法。使用乙醇做溶剂提取化合物的方法，一般认为乙醇的浓度越高越有利于总黄酮的提取，但是研究表明，高浓度乙醇适于提取黄酮苷元类，低浓度乙醇适于提取黄酮苷类，所以不同的黄酮化合物结构其提取所用的溶剂也有所不同。醇提法根据提取工艺的不同又可分为冷浸法、渗漉法和回流法。冷浸法不需加热，但费时较长，效率低；渗漉法由于保持一定的浓度差，所以提取效率较高，浸液杂质较少，但费时较长，溶剂用量大，操作麻烦；回流法效率较冷浸法和渗漉法高，速度快，但含受热易破坏成分的药材不宜用此法。 运用超声波法从紫花苜蓿中提取黄酮类化合物可以加快提取速度，提高提取效率，操作简单， 结果准确，重现性好。醇提法为有机溶剂之一，通常用到的有机溶剂有甲醇、乙酸乙酯、乙醚、丙酮等，可采用不同浓度的乙醇或是甲醇作为提取溶剂进行试验。本文就是采用醇提法加以回流来提取苜蓿中的黄酮类化合物的。143碱性水或碱性稀醇提取法1993年曹永刚［45］等人从槐米中提取芦丁，应用碱性较强的饱和石灰水作溶剂，这样则有利于芦丁成盐溶解。2002年丁力君等人从菊花中提取黄酮类物质时，用pH=10的氢氧化钠溶液浸出效果较好［46］;利用黄酮类物质大多具有酚羟基，显一定的酸性，因此可以用碱性水或碱性稀醇浸出， 经酸化后析出黄酮类物质。一般碱性溶液是稀氢氧化钠和石灰水。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多不利于纯化。石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐沉淀， 有利于浸液纯化，但是浸出效果不如 NaOH水溶液效果好，同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出。所以提取不同的黄酮类化合物，还要根据其相应结构而论。144微波提取法2007年ChenL等［47］人利用80%的甲醇在80W的功率下处理5分钟后，从嵩山侧柏中提取总黄酮，功率是常规醇提法的 3.06倍。此法需要专用微波炉。一般微波的电磁波频率在300-300000兆赫兹之间。其作用主要是微波透过物料内部维管束和腺胞系统，当物料内部的维管束和腺胞系统吸收微波升温至其内部压力超过细胞壁膨胀的能力而破裂其效成分被浸提出来； 另外微波产生的电磁场可加速被提取组分由物料内部向提取溶剂中扩散。此方法具有选择性强、快速、加热均匀、高效、清洁、不产生噪音、不造成污染的特点而被广泛使用。1.4.5超声波法2009年邓斌［48］等人以乙醇为溶剂，用超声波技术从紫花苜蓿中提取黄酮类化合物，并对所提取的黄酮类化合物进行验证，采用紫外分光光度法于 510nm处测定含量。结果表明，测得样品中黄酮类化合物的平均含量为5.32mg/g。平均回收率为99.08%。超声波法的原理是超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于黄酮类化合物的释放与溶出。超声波使提取液不断震荡，加速溶质扩散，同时超声波热效应使水温升高，加速了提取效率。使用超声波法可大大缩短提取时间，提高有效成分的提出率和原料的利用率。146酶解法2006年许明淑［49］采用酶解法提取银杏叶中总黄酮，相比未加酶对照组提取率增加44%。酶解法原理是利用纤维素酶破坏植物细胞壁的有效成分纤维素； 即利用了酶的专一性等作用来使其细胞中的有效成分暴露出来的方法， 来提取化合物。1.4.7半仿生法2007年陈丛瑾［50］等人利用半仿生法SBE法分别以pH2的盐酸溶液和pH7.5、pH8.5的氯化铵-氨水的缓冲溶液作为提取液提取香椿叶中的总黄酮醇，提取量为10.3417mg/®半仿生法原理是将原料先用一定得酸水提取， 后碱水提取，提取液分别过滤、浓缩，制成制剂用来使用的一种方法。1.4.8大孔树脂吸附法2003年李晓霞［51］考察HPD-100,HPD-300,BPD-600,AB-8，H-103等五种树脂的吸附性能，选用H-103树脂从大豆皂苷的醇提液中吸附异黄酮和皂苷，同时在柱后串联对皂苷有良好吸附性能的 BPD-600树脂回收流失的皂苷，经树脂纯化所得的皂苷纯度为53.4%。利用的大孔树脂的选择性吸附作用分离提取化合物的方法。与传统的提取方法相比，大孔吸附树脂具有以下优点：缩小剂量，提高中药内在质量和制剂水平；减小产品的吸潮性；有效去除重金属；具有较好安全性。大孔树脂是一类有机分子聚合物吸附剂，其化学稳定性高，有选择性，不收无极物影响，可再生等优点，避免了化学提取方法引进第三种物质等的缺点，而被广泛用于黄酮类化合物的提取。1.4.9超临界流体萃取1997年刘志敏［52］等人利用超临界色谱成功地分离了黄酮类化合物，研究了流动相的组成，柱条件，压力及温度的影响，发现流动相组成是影响色谱分离的最主要的因素；其次，色谱条件也是影响分离的重要因素。 超临界流体萃取技术简称SFE，是液态二氧化碳等为溶剂进行萃取，制成的超临界二氧化碳流体， 利用其高渗透能力，低粘度和其与液体相近的密度，优良的溶解能力来带出有效成分的一种方法。该技术的主要特点是提取率高、无溶剂残留、活性成分不易分解破坏等。2008年张咏梅［53］分别采用微波辅助、超声波辅助的方式，对影响提取量的多因素、多水平做了正交试验，确定优化组合：并比较两种提取方法，确定最佳提取工艺，用于生产实践；而后通过实验分离和鉴定了苜蓿中的生物活性物质；她还研究了苜蓿粗提液对多种病原细菌和小鼠的药效试验， 为苜蓿中的活性物质最终用于动物饲料添加剂提供理论基础。从以上各种提取方法中可以看出，从物质中提取化合物方法的同一性在于：

此方法能够把组成物质的最小单元细胞中的有效成分释放出来。 这些方法既有破坏细胞壁的超声，酶等；还有能从细胞中带出有效成分的超临界流体。 可见各种方法都有其特点和不足。怎样才能有效地提取不仅取决于被提取物和提取物，还有各种环境条件的影响。我想在以后的发展中必将有人能结合物理化学等作用研制出一种通用的提取方法。此外，还有多种方法相结合提取黄酮类化合物，例如：2008年冯涛［54］等人对加热回流、索氏提取、超声提取3种工艺比较，得到超声提取最好，其苜蓿的提取工艺各因素影响程度为：料液比 ＞提取次数＞提取时间＞乙醇浓度，苜蓿总黄酮最佳提取工艺参数为：超声法提取， 60%乙醇，30：1的液固比，提取3次，1h/次。苜蓿全草中含有总黄酮3.75%，苜蓿叶子中含有总黄酮4.85%。1.5黄酮类化合物的分析方法分析方法就是通过研究标准物质的性质作参照，以相关的仪器检测其吸光度，透光率，浓度等性质来间接分析其含量的一种方法。 国内分析研究方法起步迟，发展快。随着各种分析仪器的迅速发展，各种分析方法在研究检测方面得到了广泛应用，如紫外光谱、红外光谱、荧光光谱、原子吸收光谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳技术、核磁共振、 DNA分子鉴定技术、扫描电子显微镜、X-衍射及计算机图像分析、聚类分析等数理统计方法应用也越来越广泛。不过遗憾的是好多分析仪器的研制都来自国外， 对其操作方面还没有完全实现汉化。1.5.1薄层色谱法（TLC）2001年马柏林［55］等人以十二烷基硫酸钠（SDS）/正丁醇/正庚烷冰微乳液作为展开剂，以ALCL3乙醇溶液为显色剂，在波长365nm紫外灯下，发现由SDS/正丁醇/正庚烷冰微乳液按11.7/15.6/2.7/70.0的比例组成的。O/W型微乳液适于分离杜仲所含黄酮。2001年张冬冬［56］等人用硅胶G薄板，展开剂为苯/吡啶/甲酸（36/9/5），对照品为1%槲皮素甲醇液ImL,显色剂为1%二氯化铝乙醇液，在紫外光下观察，确定黄花菜含有黄酮醇类化合物。由于此方法分析简便，快速，直观等特点而被广泛应用。TLC(ThinLayerChromatography)不仅可以用在物质的鉴定上，也可用在分离中；其结合扫描仪使用，能直观的分析物质的信息。1.5.2高效液相色谱法(HPLC)1996年李典鹏［57］等人用此法测定银杏叶提取物经酸水解后黄酮苷元含量，采用CI8柱，甲醇冰/磷酸为流动相，检测波长370nm。1999年王俊德［58］等研究了用高效液相色谱法分析银杏提取物中黄酮含量时几个主要环节的操作条件， 包括水解液组成，水解温度和时间，论证了在 370nm波长下检测时，可用槲皮素一个标准物质方便地求出槲皮素、山萘酚和异鼠李素 3种黄酮的含量。色谱法分高效液相色谱和气象色谱，此种方法具有高选择，高效能，高灵敏度，分析速度快等特点。不仅可以用在痕量分析中，也可分析易挥发的液体或固体中，经常用在低分子化合物的分离与分析中，缺点就是需要样品具有热稳定性和一定的挥发性。高效液相色谱法比LTC(HighPerformaneeLiquidChromatography)更高效，可以连接各种检测仪器，适用于多类型化合物的检测。1.5.3紫外-可见分光光度法(UV)1999年刘佳佳［59］等人用硼酸-柠檬酸比色法测定了银杏叶不同季节黄酮的含量。2001年徐燕［60］等人以黄苓苷为对照品，采用双波长分光光度法测定黄苓总黄酮含量；测定波长为278nm,参照波长为242nm。同年孙立立［61］等以金丝桃苷为对照品，对全国I0个地区的山里红和山楂中的总黄酮进行了测定，结果各地样品中总黄酮含量在0.84%-3.62%,与HPLC法测定的金丝桃苷含量基本正相关。2005年黄贤校［62］等人用此法测定大豆皂苷在209nm处有最大吸收，以齐墩果酸做标准品绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明此法缺点是会有基线不稳现象。此方法测定多采用与硝酸铝进行络合显色， 以芦丁为标准溶液，在相应波长处测定黄酮类化合物的含量。分光光度法特点是设备简单，适用性广，准确度高，精密度好等，其原理是利用分子在200-800纳米的光谱区有吸收，通过测定其吸光度，来进行物质的分析测定。本文就是用的紫外 -可见分光光度法来测定提取物总黄酮的含量；另外，此方法经常还被用在皂苷、酚酸、一些糖类等提取物的检测中。1.5.4高效毛细管电泳（HPCE）2001年朱加虹［63］利用此法分离银杏叶提取物中的黄酮类化合物芦丁和槲皮素，研究有关的测定条件，结果表明：以pH为8.5的50mol/L硼酸盐溶液为缓冲液，加入35mol/L的SDS（十二烷基硫酸钠），在电压20kV，柱温2C,检测波长203nm条件下对样品进行电泳，其中的芦丁和槲皮素可以完全分离。高效毛细管电泳原理是以电场为推动力，在毛细管中按其高度不同而实现分离的技术。HPCE（HighPerformaneeCapillaryElectrophoresis）仪器操作简单方便，分离效能高，分析速度快等特点。由于多数黄酮类合物的沸点较高，难于气化，进行GS要先将样品制成黄酮衍生物，这就使得GC方法繁琐，应用不是很普遍。TIC法分析时间长，分析结果重现性较差。分光光度法，适合测定总黄酮的含量，由于一些酚类物质的干扰使得测定结果偏高。优点是所用设备简单，操作容易。SFC色谱法既可以分析GC难以处理的高沸点，热不稳定的样品，与HELC相比柱效更高，分析时间更短。HPLC、HPCE可分离极性离子、易挥发的高分子量和热不稳定化合物。 HPCE与HPLC相比具有快速、微量分析的特点，缺点是其仪器价格昂贵，普及需要一定的时间。色谱一质谱联用方法分离效率高、分辨能力强、灵敏度高、分析速度快［64］。目前，随着现代光谱技术的发展，越来越多复杂化合物被揭开了神秘的面纱。人们开始以科学的方法和态度去研究物质的结构。可以想象在不远的将来，纷繁复杂的自然界将会以其最可爱的面目呈现在人们面前。1.6研究黄酮类化合物的目的及意义由于黄酮类化含物具有抗氧化作用，可以清除人体内活性氧，保护人体内脂质、蛋白质、染色体免受活性氧攻击，防止细胞病变，增强人体免疫力，延缓衰老；同时可防止胆固醇在动脉上的沉积，避免血液凝结成块，以减少动脉硬化发生的机率；类黄酮素也可以阻断某些荷尔蒙的不良活动， 抑制引起发炎的酵素活动，还可以抑制微血管增生等优良的作用而被受关注。 因此，通过各种方法提取分离出黄酮类化合物，解决人体健康等问题，对社会的发展和进步是非常重要的。黄酮类化合物的研究主要从其类别性状、理化性质、生物活活、提取、分离工艺、分析方法等方面来研究的。研究主要从物质本身属性出发，从宏观的定量、定性的理化研究到微观的提取、分析和分离方法的研究，最后进行各种放大和稳定性测试，从而实现大规模生产以解决实际需求问题。本论主要研究的是紫花苜蓿叶，枝干部位。国内对不同地区和不同产地的紫花苜蓿中总黄酮提取工艺报道的很多，但从宁夏石嘴山市盐碱地种植的紫花苜蓿中提取总黄酮的研究方面未见报道。本实验以宁夏石嘴山市大武口区盐碱地种植的苜蓿为研究对象， 通过单因素的影响进行正交实验，优选出最佳提取工艺条件，为宁夏石嘴山地区苜蓿的进一步开发利用提供理论参考。

2.1仪器及试剂第2章实验部分表2.1实验所用仪器仪器厂家烘箱上海实验仪器厂有限公司（101A-2型）旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂（RE-52A型）循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司（SHB-m型）紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司）恒温加热磁力搅拌器上海实验仪器厂有限公司（DF-101Z集热式）电子天平上海方瑞仪器有限公司表2.2实验所用药品试剂厂家蒸馏水自制芦丁对照品国药集团化学试剂有限公司产品硫酸有限公司上海晶纯试剂公司乙醇天津市永大化学试剂开发中心无水硫酸钠天津市富宇精细化工有限公司无水硫酸镁天津市富宇精细化工有限公司盐酸天津市富宇精细化工有限公司除此之外，实验中还用到了胶头滴管，长滴管，烧杯，量筒，移液管，洗耳球，容量瓶，圆底烧瓶，锥形瓶，蛇形冷凝管，球形冷凝管，直形冷凝管，气球等。2.2实验内容2.2.1原料苜蓿的收集和预处理本论文收集2014年6月份生长在宁夏理工学院园林区的苜蓿，经晒干后在100C的条件下干燥2小时，然后粉粹到40-60目之间，根据实验安排在天平室称量成质量不等的若干备用。

222最大吸光度的选择准确称取基准物质芦丁35.7mg,用30%的乙醇液溶解后，定容到250mL的容量瓶中，摇匀后装进比色皿中，调节波长测定吸光度，找出不同波长下黄酮标准样最大吸光度。就丘|rmj图2.1最大吸光度从图2.1可以看出标准物芦丁在380nm处吸光度最大，所以测量波长定为380nm。2.2.3标准曲线的制作准确称取基准物质芦丁35.7mg,用30%的乙醇液溶解后，定容到250mL图2.2标准曲线的容量瓶中，再从250mL的容量瓶吸取25mL的标准液，用30%的乙醇溶液定容到50mL的容量瓶中，用移液管分别移0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL的标准溶液到10mL的容量瓶中，用30%乙醇定容后分别测定吸光度，建立标准曲线。分析图2.2得到标准曲线线性回归方程为：A=0.0046+20.7918C第线性因子R=0.99987。[2t1VW1d89曲7Graph1"(245AfM)]LinearRegressionForDalalB:V=A*B*X _UalueErrorO.W0.0039020.79185fl.15078RSDHPA.005767图2.3标准曲线分析结果2.2.4单因素实验(1)固液比对总黄酮提取量的影响准确称取1.00g的苜蓿5份，分别装入已标好的5个圆底烧瓶中，用固液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的30%的乙醇溶液侵泡24h,然后在60C的条件下加热回流1h，冷却后用活性炭脱色24h减压过滤收集滤液，用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，摇匀后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，分别测量吸光度，分析固液比对总黄酮提取量的影响，实验结果如表2.3。表2.3固液比对总黄酮提取量的影响编号质量固液比AA平均11.00171:100.2340.2370.2350.23521.00001:200.250.2480.2490.24931.00711:300.3040.3090.3080.30741.00351:400.3720.3670.3660.36851.00451:500.3650.3620.3630.363(2)乙醇浓度对总黄酮提取量的影响准确称取1.00g的苜蓿5份，分别装入已标好的5个圆底烧瓶中，用30mL

浓度为30%、40%、50%、60%、80%和100%的乙醇溶液侵泡24h后，60C的条件下加热回流1h提取总黄酮，冷却后用活性炭脱色24h减压过滤收集滤液，用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，摇匀后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，分别测量吸光度实验数据见表2.4。表2.4乙醇浓度对总黄酮提取量的影响编号质量浓度AA平均11.004030%0.2510.2530.25221.000040%0.3340.3350.33531.002060%0.3420.340.34141.005080%0.3320.3260.32951.0000100%0.170.1710.171(3)温度对总黄酮提取量的影响准确称取1.00g的苜蓿8份，分别装入已标好的8个圆底烧瓶中，用30mL浓度为30%乙醇溶液侵泡24h后，分别以温度为30C、40C、50C、60C、70C、80C、90C和100C的条件下加热回流1h提取总黄酮，冷却后用活性炭脱色、减压抽滤收集滤液，后用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，摇匀后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，实验数据见表2.5。表2.5温度对总黄酮提取量的影响编号质量温度AA平均11.0013300.3080.3080.308021.0021400.3080.3090.308531.0013500.3460.3460.346041.0026600.3610.3600.360550.9983700.2880.2880.288061.0068800.2600.2610.260571.0054900.2770.2780.277581.0085950.2940.2930.2935(4)时间对总黄酮提取的影响准确称取1.00g的苜蓿5份，分别装入已标好的5个圆底烧瓶中，用30mL

浓度为30%乙醇溶液侵泡24h后，分别以时间为1h、2h、3h、4h、5h和6h的条件下加热回流1h提取总黄酮，冷却后用活性炭脱色、减压抽滤收集滤液，后用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，摇匀后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，实验数据见表2.6。表2.6时间对总黄酮提取的影响编号质量时间AA平均11.004120.3140.3120.3110.312321.000730.3100.3080.3050.308331.004140.3160.3170.3170.316741.001550.3560.3550.3520.354351.001460.3290.3290.3330.3303（5）提取次数对总黄酮提取量的影响准确称取1.00g的苜蓿5份，分别装入已标好号的5个圆底烧瓶中，用30mL浓度为30%乙醇溶液侵泡24h,后加热回流1h提取总黄酮，冷却后用活性炭脱色、减压抽滤收集滤液，然后用30%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，摇匀后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，测其吸光度；残渣用上述相同的方法重复实验提取4次测吸光度，得到实验数据见表2.7。表2.7提取次数对总黄酮提取量的影响编号AA平均10.3420.3410.340.34120.1460.1460.1480.14730.0910.090.090.0940.0550.0550.0550.05550.0380.0390.0350.0372.2.5正交实验如表2.8所示，由于苜蓿的提取量受回流时间、温度、固液比和浓度4个因素的综合影响，为了全面研究4个因素对总黄酮提取的影响，根据单因素实验结果，以苜蓿的提取量为考察指标，设计L9（34）正交试验，按照正交实验设计表中各个样品配制方法测定，由线性方程计算得不同条件下的提取量，进行极差分析,确定最佳提取条件。表2.8正交实验设计表水平因素浸提时间（h）固液比（g/mL）乙醇浓度（%）浸提温度「C）141:3050%50251:4060%60361:5070%70第3章结果与讨论3.1单因素结论分析3.1.1固液比对总黄酮提取影响结论对表2.3固液比对总黄酮提取量的影响数据进行处理得到表 3.1：表3.1固液比与总黄酮提取的关系固液比1:101:201:301:401:50提取量（mg/g）5.53125.87737.22088.70858.5802对表3.1在计算机软件上处理得到图3.1：图3.1图3.1固液比对总黄酮提取影响営)三」4由图3.1可得：在固液比为1:40时总黄酮的提取量最好为8.7085mg/g。3.1.2乙醇浓度对总黄酮提取影响结论表3.2乙醇浓度对总黄酮提取量的影响乙醇浓度30%40%50%60%80%100%提取量（mg/g）5.92587.94548.07368.15677.76234.0016由表2.4的数据，通过计算可得到表3.2：对表3.2在计算机软件上处理得到图3.2，由图3.2得：乙醇浓度为60%时,总黄酮的提取量最好为8.1567mg/g。

40% 0Q% so% 100%浓度C%>图3.2乙醇浓度对总黄酮提取影响3.1.3温度对总黄酮提取影响结论30 40 5D SQ 7Q 80 90 10G温度（工）

图3.3温度对总黄酮提取影响由表2.5的数据，通过计算可得到表 3.3：表3.3温度对总黄酮提取影响温度「C）405060708090100提取量（mg/g）7.29298.19938.53656.82686.52746.11236.5274对表3.3在计算机软件上处理得到图3.3，由图3.3得到温度为60C时，总黄酮的提取量最好为8.5365mg/g。3.1.4时间对总黄酮提取影响结论由表2.6的数据，通过计算可得到表 3.4:

表3.4时间对总黄酮提取影响时间（h） 1 2 3 4 5 6提取量（mg/g） 5.9258 7.3693 7.2983 7.4747 8.3970 7.8215对表3.4在计算机软件上处理得到图3.4：1 2 3 4 S « 7 B时间01）图3.4时间对总黄酮提取影响由图3.4得：时间为5h时总黄酮的提取量最好为8.3970mg/g3.1.5提取次数对总黄酮提取量影响结论图3.5提取次数对总黄酮提取量影响由图3.5可得提取两次总黄酮的提取量最好， 经过多次提取得到黄酮的总质量为15.5590mg/g。

由表2.7的数据，通过计算可得到表 3.5:表3.5取次数对总黄酮提取量的影响次数 1 2 345提取量(mg/g) 8.0897 3.4244 2.05371.21200.7791对表3.5在计算机软件上处理得到图3.5:3.2正交实验结论经过正交实验的分析，反应时间、固液比、乙醇浓度和温度4因素均对苜蓿总黄酮的提取量具有极显著的影响，且4因素的影响主次分别为乙醇浓度＞时间＞温度〉固液比；从而得出最佳提取工艺为反应时间6h、固液比为1:40、乙醇浓度为50%、温度为70C，在此条件下，紫花苜蓿总黄酮提取量为8.7813mg/g。对表2-8中的数据进行处理可得到表3.6:表3.6正交实验结果及数据处理编号因素黄酮含量（mg/g）时间（A）固液比（B）乙醇浓度（C）温度（D）11(4h)1(1:30)1(50%)1(50C)8.2780212(1:40)2(60%)2(60C)7.8057313(1:50)3(70%)3(70C)5.251542(5h)1236.0457522315.5687623128.275573(6h)1326.1115832138.7813933217.9538K121.335220.435225.334821.8005

续表3.6正交实验结果及数据处理因素黄酮含量编号（mg/g）时间（A）固液比（B）乙醇浓度（C）温度（D）K219.889922.155721.805222.1927K322.846621.480816.931720.0785R2.95671.72058.40312.1142最优因素及顺序A3B2C1D3C>A>D>B3.3稳定性测定准确称取1.00g备用的苜蓿5份，装入已经标号的5个圆底烧瓶中，用固液比为1:40的50%乙醇溶液浸泡24h,在温度70C条件下回流6h,用活性炭脱色24h后减压过滤收集滤液，用50%的乙醇溶液定容于100mL容量瓶中，摇匀后取2mL溶液定容于10mL容量瓶，测量吸光度。表3.7稳定性测定设计编号质量（g）AA平均10.99650.3460.3450.4600.38621.00310.3720.3720.3710.37230.99960.3590.3610.3600.36041.00000.3630.3650.3650.36451.00420.3690.3680.3690.369对表3.7的数据进行处理可得表3.8:表3.8稳定性测定结果时间（h）12345提取量（mg/g）9.20418.80798.55018.64288.72648.5501mg/g-9.2041通过正交实验得到的最佳工艺参数对黄酮的总提取量在8.5501mg/g-9.2041mg/g之间，单次提取率在54.9%到59.2%之间，工艺稳定3.4结果与讨论3.4.1结果分析单因素实验结果：通过对影响提取紫花苜蓿中总黄酮的各单因素分析，我们得到了在固液比为1:40、乙醇浓度为50%、温度为60C、回流时间比为5h,提取次数为两次时总黄酮的提取量最好。正交试验结果：通过正交实验探究，我们得到了苜蓿总黄酮提取工艺的最佳条件为回流时间6h、固液比为1:40、乙醇浓度为50%、温度为70C时总黄酮的提取量最好。3.4.2讨论与展望单因素实验结果与正交试验结果不同，原因在于：单因素实验是定量分析，即实验中仅仅考虑单一因素的变化对总黄酮提取量的影响，而正交实验是考虑了回流时间、固液比、乙醇浓度和温度四种条件共同作用的结果。 因此在提取黄酮时我们应以正交实验结果为主，全面考虑影响总黄酮提取量的因素。为此，我们在正交试验的基础上做了稳定性测试，通过稳定性测试我们得到黄酮的提取量在8.5501mg/g-9.2041mg/g之间，工艺稳定。苜蓿中含有多种生物活性成分如皂苷类、黄酮类、生物碱、膳食纤维、多糖类、叶蛋白类、维生素E、香豆素类和有机酸类等，这些活性成分具有护肝、解肝毒、抗真菌及抗自由基、抗氧化和预防三高等作用；但是对其利用却主要集中在干草加工和饲料等方面，这样不仅浪费了资源，更不利于苜蓿的稳定发展。通过研究我们知道：苜蓿的附加价值高，市场潜力。随着社会的发展，人们生活水平的提高，随之而来的亚健康问题也越来越严重，像肥胖、高血压、高血糖等问题也越来越突出，2002年中国营养和健康调查数据显示，14.7%的中国人体重超标，2.6%的中国人属于肥胖；2012年中国医学杂志报道，中国成年人中高血压患病率高达33.5%，患病人数多达3亿人，45万人死于高血压；2014年太原晚报中报道，全国高血压患者为2.66亿，每5个人中至少有一人患高血压。为什么这些亚健康患者的人数会居高不下？原因之一在于没有好的药物来控制这些疾病；而且宁夏地区苜蓿中黄酮类化合物的研究数据几乎是空白。 所以，通过研究即可为人类的健康问题提供一份保障，也能为本地区研究紫花苜蓿中黄酮类化合物的研究者提取提供参考数据参考文献高微微，何春年，佟建明•我国苜蓿属植物资源及应用概况[J].时珍国医国药,2006,17(5):680-683.赵祥.苜蓿产业化生产与加工利用 [M].山西：金盾出版社，2002,1-5.何春年，李展，高微微等.苜蓿属植物的黄酮类化学成分研究概况 [J].中国药学杂志，2006,41(8):565-568.曹致中.优质苜蓿栽培与利用[M].北京：中国农业出版社，2002,1-11.⑸耿华珠•中国苜蓿[M].北京：中国农业出版社，1995,1-10.El-KhrisyEAM,AbdelHOM,KhattabAA,eta1.ChemicalconstituentsofMedicagosativaL[J].Bu11.Natl.Res.Cent,1994,19(2):117-122.张纵圆，彭秧，符继红.新疆紫花苜蓿挥发油化学成分的分析 [J].质谱学报，2008,29(1):42-45.王奇丽，白志明.苜蓿中的生物活性成分及其研究进展[J].现代农业科技,2008,22(3):223-224.何春年，高微微，佟建明.苜蓿属植物的皂苷类化学成分[J].中国农业学报,2005,21(3):107-108.王东冬.大豆皂苷的提取纯化与分离检测 [D].上海:上海交通大学,2006.倪刚.部分黄酮类化合物含量测定、毒副作用及生物利用度研究 [D].山东:山东大学,2007.孙彦，龙瑞才，张铁军等.紫花苜蓿皂苷研究进展[J].草业学报,2013,22(3):275-276.王胜超，张国刚，米文珍.紫花苜蓿化学成分及药理作用研究进展 [J].沈阳药科大学学报,2009,26(3):244-247.王彦华，王成章，史莹华等.苜蓿多糖的研究进展[J].草业科学,2009,24(4):51-53.王彦华，王成章，史莹华等.苜蓿多糖的研究进展[J].草业科学,2007,24(4):51-52.刘晓峰，达哇卓玛，杨国柱.紫花苜蓿中多糖的提取方法研究[J].安徽农业科学,2008,41(14):6302-6304.王蓟花，周立刚，韩建国.紫花苜蓿化学成分及其生物活性与开发利用 [J].天然产物研究与开发,2009,21(9):346-353.魏伯平，张咏梅，曹致中等.超声波辅助提取苜蓿中黄酮的研究[J].草原与草坪,2010,30(6):2-5.陈兵兵.三种苯并吡喃类黄烷酮天然产物的全合成研究 [D].宁夏，宁夏大学,2014.王胜超，张国刚，米文珍.紫花苜蓿化学成分及药理作用研究进展 [J].沈阳药科大学学报,2009,26(3):243-248.张亮.新疆紫花苜蓿皂苷的提取、分离及纯化研究 [D].新疆，新疆大学,2009.倪刚.部分黄酮类化合物含量测定、毒副作用及生物利用度研究 [D].山东，山东大学,2007.陈佩佩.苜蓿鲜草中黄酮的提取及分离纯化的工艺研究 [D].湖南,湖南农业大学,2013.胡春.黄酮类化合物的抗氧化性质 [J].中国油脂，1996,4(21):18-19.黄池宝，罗宗铭，宾利英.黄酮类化合物抗氧化性及结构关系的研究 [J].广东工业大学学报,2000,17(2):71-75.候滨滨.金莲花中黄酮类化合物提纯及抗氧化性检验 [D].天津，天津大学,2008.方玉梅，张春生，王毅红等.金针菇黄酮类化合物抗氧化性的作用 [J].食品研究与开发,2012,33(3):1-5.KoCH,shenSC,LeeTJF,etal.Myricetininhibis matrixmetalloproteinaese2proteinexpressionandensymeactivityincolorectalcarcinomacells[J].MolCancerThe,2005,4(2):281-290.LuJ,PappLV,FangJG,etal.Inhibitionofmammalianthioredoxinreductasebysomeflavonoids:implicationsformyricetinandquercetinanticanceractivity[J].CancerRes,2006,66(8):4410-4418杨博，李志裕，尤启东.黄酮类化合物的抗肿瘤作用机制研究进展[J].药学进展,2008,3(9):391-393.HertogMGL,FesekensEJM,KromboutD.RelationbetweenintakeofflavonoidsandriskforcoronaryheartdiseaseintheZetphenelderlystudy[J].TheLancet,1993,342(8878):1007-1011.CuiXQ,WangL,YanRY,etal.JournalofAsianNaturalProductsResearch[J].2008,10(4):315-318.ZhangDW,LiGH,YuQY,etal.Newanti-inflammatory4-hydroxyisoflavansfromSolanumlyratum[J].ChemicalandPharmaceuticalBulletin,2010,58(6):840-842.OnoK,NakaneH,FukushimaM,etal.Inhibitionbyreversetranseriptaseactivityofaflavonoidcompound5,6,7-trihydroxyflavone[J].BioehemBioPhysResCommun1989,160(3):982-983BourjotM,ApelC,MartinMT,etal.Antiplasmodial,AntitrypanosomalandCytotoxicActivitiesofPrenylatedFlavonoidsIsolatedfromArtocarpusstyracifolius[J]. 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