发酵4项目四：菌种的扩大培养课件

项目四菌种的扩大培养将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。概念单元知识一种子扩大培养工艺

菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短生理形状稳定菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求无杂菌污染保持稳定的生产能力

条件实验室种子制备固体培养适于产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快的菌种，产生的孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌细菌芽孢的制备。细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富配方，培养温度一般为37℃，产芽孢细菌需要培养5~10天。霉菌孢子的制备。霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为25~28℃，培养时间为4~14天。放线菌孢子的制备。放线菌的培养基中含有麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度一般为28℃，培养时间为5~14天。液体培养适于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种好氧培养。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子接入种子罐，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌厌氧培养。对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：试管→三角瓶→卡式罐→种子罐通过种子罐逐级培养，然后向发酵罐大量地接入培养成熟菌种可以缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，提高了设备利用率；节约了发酵培养的动力消耗；并有利于减少染菌机会。摇瓶培养三角瓶进行，液体恒温振荡，即摇瓶，摇瓶培养为一级种子培养。培养基特点：使用的原料基本接近于发酵培养基。种子制备过程中，因菌种不同，可采用不同种子罐级数。种子罐级数是指制备种子需要在种子罐中逐级扩大培养的次数。一般根据种子罐从小到大的顺序，将最小的称为一级种子罐，次小的称为二级种子罐，依次类推。其它依次类推。级数的确定一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌（如谷氨酸），种子用量比较少，级数也较少，如谷氨酸生产为二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐—二级发酵培养（一级种子罐扩大培养）对于生长较慢的霉菌：如青霉菌，三级发酵。茄子瓶→种子罐→种子罐→发酵罐—三级发酵培养（二级种子罐扩大培养）放线菌：生长更慢，链霉素生产采用四级发酵。酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子生产。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会；但种子级数太少，则接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。三级发酵培养过程

单元知识二种子质量的控制

影响种子质量的因素影响种子质量的因素培养基培养条件种龄接种量温度湿度通气量种龄接种量培养条件相对湿度（%）斜面外观活孢子计数（亿/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄、下部稠略黄上部薄、中部均匀发白一片白，孢子丰富，稍皱1.22.35.7不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响相对湿度在40%~45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。种子质量的控制措施无（杂菌）检查菌种稳定性的检查控制每批生产斜面的使用时间菌体形态生化指标测定种子液中糖、氮、磷的含量,pH变化来确定种子的质量产物生成量酶活力种子液中，某种酶的活力与目的产物的产量密切相关，因此，可以间接反映种子的质量种子质量标准将斜面种子或米孢子接入含液体培养基的锥形摇瓶（又称三角摇瓶）中，于摇床上恒温振荡培养，获得液体种子，叫摇瓶种子。摇瓶种子可在摇瓶种传代，第一代为母瓶，第二代称为子瓶。单元技能一实验室摇瓶种子的制备摇瓶种子制备流程培养基配制分装接种:孢子悬液或斜面种子培养保存摇瓶种子制备过程分装和灭菌三角摇瓶用棉塞或泡沫塑料棉塞，置高压灭菌器中灭菌。装量要适当，以保证良好的通气一般情况下，参考装量为40～50ml/250ml瓶，60～80ml/500ml瓶，90～110ml/750ml瓶，120～150ml/1000ml瓶；厌氧培养，则装量应增加一倍以上。灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上。摇瓶种子制备接种一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数法。这种方法难于掌握接种量，从而影响摇瓶种子的质量。为此可以采用用无菌蒸馏水将斜面种子或孢子制成细胞或孢子悬液，然后按一定体积或一定细胞或孢子数接种至摇瓶培养基中。在一定的体积接种之下，活菌量越多，意味着下一级种子的接种量越大，下一级种子生长越快。但菌体浓度也不能太高，否则影响摇瓶中的菌体对营养成分的竞争及气体交换，降低菌体生长质量。摇瓶种子制备恒温振荡培养注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差，一般摇床上层的温度高于下层，中间的温度高于边缘。为避免不同位置上摇瓶种子质量的波动，培养时，最好在具有相同温度带的摇床固定位置上进行。培养时间一般应将摇瓶种子的生长阶段控制在对数生长的后期。可通过观察外观粘稠度、静置沉降量或测定离心湿菌体体积以及显微镜检查进行判断。摇瓶种子制备培养基配制

摇瓶培养的目的是获得具有较强生命力的营养菌体，因而摇瓶培养基应全面、均衡和丰富，以便充分满足菌体的生长和对各种营养物质的要求。配制时要考虑营养成分中生理酸、碱性物质的平衡搭配或加入磷酸盐、碳酸钙等缓冲剂来控制培养过程中的pH变化。摇瓶种子在培养过程中一般不便于调节pH。摇瓶种子制备微孔接种火圈保护接种压差接种单元技能二无菌接种（移种）操作

无菌接种（移种）操作利用注射器在罐的接种口橡皮膜上注入罐内进行接种操作时要注意防止注射器针孔堵塞微孔接准备摇瓶菌种、酒精棉花、钳子、镊子和接种环。用酒精棉擦洗罐顶接种口，并在接种口四周围放上酒精棉。接种者双手用酒精棉擦洗消毒、晾干。调节进气阀，减少进气量，维持罐压0.01～0.02MPa（不能关闭，否则罐压跌零，引起污染），然后拧松接种口螺母，点燃接种口四周的酒精棉。火圈保护接种纯种的接种瓶上装有橡皮管，在火封下与罐的接种口相连接，要求瓶与橡皮管的连接不漏，橡皮管与接种口的大小一致。然后开大种子罐排气阀门，降低罐压同时拿掉接种叉，开大接种阀门，利用两者的压力差使种子进入罐内，即可完成接种。压差接种生产上大型发酵罐常采用压差移（接）种法。即在种子罐（瓶）压力大于发酵罐压力的条件下将种子转移到发酵罐内。从种子罐到发酵罐的移种，是通过接种管道，在压力作用下进行的。移种前，对移种管路，阀门用蒸汽灭菌20min，一般种子罐与发酵罐的一段连接管路的灭菌与发酵罐的灭菌是同时进行的。移种时，种子罐保持0.08Mpa，发酵罐保持0.03Mpa，打开移种管路上的阀门，种子在压差作用下，由种子罐转入发酵罐。菌种保藏是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异，长期保持菌种原有的优良性状。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，抑制菌种繁殖能力，使其处于“休眠”状态。单元技能三工业菌种的保藏菌种保藏的原理斜面低温保藏

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，置于4℃冰箱保藏，保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2~4个月，移种一次。酵母菌2个月，细菌最好每月移种一次菌种保藏方法石蜡油保藏

先将液体石蜡（亦称石蜡油）．装入三角瓶中，装量不超过三角瓶总体积的1/3，塞上棉塞，报纸包扎后，灭菌，连续灭菌2次，然后放在室温或40℃温箱中1周，蒸发掉水气，石蜡油变为透明状．备用。将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。用灭菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面上，其用量高出斜面顶端lcm为准，使菌种与空气隔绝．将试管直立，置低温或室温下保存。菌种保藏方法砂土管保藏

将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。菌种保藏方法菌种保藏方法砂土管保藏步骤沙土管制备制备菌悬液干燥纯培养检查保藏菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。即生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失。

*注意退化和污染与一般性的表型改变。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵力的降低，或抗噬菌体能力降低。对通过诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。

单元技能四菌种的复壮何谓菌种退化基因突变菌种退化的主要原因是有关基因的负突变控制产量的基因发生负突变会引起产量下降控制孢子生成的基因发生负突变则孢子性能就会下降这些负突变都是自发形成的引起菌种退化的原因粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)H-2892菌株生产力为18g/L组氨酸，经5次传代后因回复突变型增多，产量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、产生气生菌丝和色素等性状都部分或全部受质粒基因控制。当菌株连续传代、菌体发生质粒脱落而出现大量光秃型菌落，则生产能力也显著下降。引起菌种退化的原因引起菌种退化的原因变异菌株性状分离变异菌株性状分离也会引起高产性状的丧失菌种筛选工作中经常遇到初筛摇瓶产量很高，复筛产量逐渐下降而被淘汰的现象，在霉菌中更为常见。这是一种广义的退化现象。当诱变的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成，而其中只有一个孢子或细胞是高产时，在移接传代过程中，这个高产菌株数量减少，当然产量也就下降。引起菌种退化的原因连续传代连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。引起菌种退化的原因其它因素温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少产腺苷的黄膘吟缺陷型，若在培养基中加入黄嘌呤、鸟嘌呤及组氨酸和苏氨酸可降低回复突变的数量控制传代次数基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以降低突变机率。一般情况下，斜面每移植一代，霉菌、