DNA的生物合成名师优质课赛课一等奖市公开课获奖课件

DNA生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication

第九章第1页中心法则（centraldogma）遗传信息传递方向规律基因表示：是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质过程第2页第3页复制(replication)是指遗传物质传代，以母链DNA为模板合成子链DNA过程。复制亲代DNA子代DNA第4页复制基本规律BasicRulesofDNAReplication

第一节第5页一、半保留复制试验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补子链。子代细胞DNA，一股单链从亲代完整地接收过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制概念第6页AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成复制叉子代DNA

目录第7页密度梯度试验

——试验结果支持半保留复制构想。含重氮N15-DNA细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果第8页按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA碱基序列一致，即子代保留了亲代全部遗传信息，表达了遗传保守性。半保留复制意义遗传保守性，是物种稳定性分子基础，但不是绝正确。第9页二、双向复制原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，称为双向复制。复制中放射自显影图象第10页Cairns复制模型—θ型复制第11页第12页A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中两个复制叉C.复制靠近终止点(termination,ter)oriterABC第13页5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’第14页（2）起始点和方向

①原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定位置起始，如大肠杆菌起始点有固定重复保守次序，可被酶识别。

②方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称。

③速度：原核生物复制叉移动快(约105bp/min);

真核生物复制叉移动慢

(约5×102～5×103bp/min)第15页复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）第16页三、复制半不连续性3535解链方向3´5´3´3´5´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)第17页顺着解链方向生成子链，复制是连续进行，这股链称为领头链(前导链）。另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制链称为随从链（后随链、滞后链）。复制中不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制半不连续性。

第18页参加DNA复制物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNADNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链DNA母链引物(primer):

提供3’-OH末端使dNTP能够依次聚合

其它酶和蛋白质因子第19页一、复制化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

目录第20页聚合反应特点

除了底物和酶外，DNA新链生成需引物和模板；新链延长只可沿5’→3’方向进行。第21页二、DNA聚合酶全称：依赖DNADNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.5'→3'

聚合酶活性2.核酸外切酶活性第22页第23页5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3'→5'外切酶活性

5'→3'外切酶活性?能切除突变DNA片段。能识别错配碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性目录第24页第25页第26页第27页第28页第29页第30页功效：

①

5′→3′聚合酶活性；酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥聚合作用②

3′→

5′外切酶活性；主要是对新生DNA链进行校对，预防“错配”③

5′→3′外切酶活性。主要是对DNA损伤修复，以及在DNA复制时RNA引物切除及其空隙填补

可见，DNApolⅠ是1个多功效酶第31页323个氨基酸小片段5'→3'核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性3'→5'核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是试验室合成DNA，进行分子生物学研究中惯用工具酶。

第32页功效是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。

DNA-polⅢ(250kD)第33页第34页α亚基含有5′→3′方向合成DNA催化活性ε亚基含有3′→5′外切酶活性，起校对功效，可提升聚合酶Ⅲ复制DNA保真性亚基可能起组建作用β亚基如同夹子，功效是识别引物、夹住DNA

分子向前滑动亚基起着促使关键酶二聚化作用其余亚基组成-复合物，主要功效是帮助亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有增强关键酶活性作用第35页（二）真核生物DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链主要酶，有解螺旋酶活性。参加低保真度复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol第36页第37页（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白第38页解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整

第39页拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类第40页第41页第42页第43页第44页第45页五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻DNA链连接成一条完整链。以NＡＤ＋（大肠杆菌）或ＡＴＰ（真核细胞）为能源。DNA连接酶(DNAligase)作用方式第46页HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’目录第47页第48页DNA连接酶在复制中起最终接合缺口作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程主要工具酶之一。功效第49页（一）复制起始需要处理两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物DNA生物合成

第50页原核生物E.coli为例复制由起始点oriC(origin)开始双向复制E.coli复制起始点oriC（245bpDNA组分）序列分析有以下特点

3组串连重复序列(13bp），每个次序都由GATC开始

2组反向重复序列(9bp)4个dnaA蛋白结合部位第51页1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参加下,DanA蛋白变性13个bp重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生能量在DnaC帮助下沿5’→3’

方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。第52页第53页第54页DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3535引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为引发体。

第55页3535引物是由引物酶催化合成短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第56页第57页

DNA复制调控是在起始阶段进行，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。复制起点是以一条链为模板起始DNA合成一段序列。有时，两条链复制起点并不在同一点上（不对称复制，如D环复制）。在一个完整细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物复制起点，都是富含A.T。第58页（二）复制延长复制延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延长中子链上，其化学本质是磷酸二酯键不停生成。

第59页5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol目录第60页领头链合成目录第61页随从链合成目录第62页第63页第64页第65页第66页第67页原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片段在复制终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）复制终止第68页

细菌复制终止区含有多个约22bp终止子(terminator)位点，E.coli有7个终止子位点。第69页

新合成两条染色体DNA分子相互连在一起，被拓扑异构酶IV分离第70页DNA复制分子机制基本特点复制结果是半保留复制，复制过程是半不连续复制。复制以复制单位进行，起始于特定位点（复制起点）。复制能够是单向，也能够是双向，后者更为常见。复制时，DNA两条链都从5′端向3′端延伸。第71页前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。DNA合成始于RNA引物合成，所以前导链只有一次RNA合成，滞后链冈崎片断每个都有RNA引物合成。RNA引物随后由DNA片段替换，相邻DNA片段连接形成一条完整DNA链。DNA聚合酶校对功能和细胞错误修复功能维持DNA分子准确性和忠实性。第72页哺乳动物细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物DNA生物合成

•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M调整，与蛋白激酶活性相关。•蛋白激酶经过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。第73页•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同时起动。•复制起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参加。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制起始第74页3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体（二）复制延长第75页染色体DNA呈线状，复制在末端停顿。复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。染色体两端DNA子链上最终复制RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制终止第76页53355335+5333355目录第77页诺贝尔生理学/医学奖：端粒和端粒酶怎样保护染色体第78页端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端结构。功效•维持染色体稳定性•维持DNA复制完整性结构特点•由末端单链DNA序列和蛋白质组成。•末端DNA序列是屡次重复富含G、C碱基短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…第79页端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成第80页端粒酶爬行模型（动画演示）第81页第82页真核生物DNA复制特点4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长原核生物染色体DNA复制中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采取更多复制起点。1、真核生物染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp。3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为1000～

3000bp/min(仅为原核生物1/20～1/50）。第83页5、真核生物有各种DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正复制酶，在PCNA存在下有连续合成能力。PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲβ-夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串重短复序列组成，端粒功效是稳定染色体末段结构，预防染色体间末端连接，并可赔偿滞后链5’-末段在消除RNA引物后造成空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA逆转录酶.7、RPA：真核生物单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填补缺口。第84页最少依赖三种机制1、恪守严格碱基配对规律2、聚合酶在复制延长中对碱基选择功效（按模板要求选择底物）3、复制犯错时有即时校读功效复制忠实性确保第85页核酸生物合成三、DNA复制调控

原核生物DNA甲基化以及与细胞质膜相互作用能够影响复制起始时间。酶：Dam甲基化酶（腺嘌呤甲基化酶）位点：GATC中腺嘌呤N6位方式：游离oriC第86页核酸生物合成复制时间与染色质结构、DNA甲基化以及转录活性相关。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。复制许可因子（replicationlicensingfactor）所控制.该因子为复制起始所必需，但一旦复制起始后它即被灭活或者降解。因为该因子不能经过核膜，只能经过有丝分裂在重建核结构时才能进入核内并作用于染色体复制起点，这使其仅在有丝分裂后期才能与复制起点相互作用。真核生物复制起始是受各种因子调控，这些因子磷酸化和去磷酸化直接影响着复制起始。第87页逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

第88页逆转录病毒细胞内逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA第89页逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目标基因主要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成与mRNA碱基序列互补DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA第90页DNA损伤（DNAdamage）指一个或多个脱氧核苷酸组成、复制或表型功效异常改变，也称DNA损伤，又称突变（mutation）突变结果引发遗传信息改变。

DNA突变(损伤)大多数是自发，是进化与分化基础。原因：自发突变诱发突变第91页引发突变原因物理原因紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV第92页化学原因目录第93页突变分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)

第94页DNA分子上碱基错配称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2.颠换（一）错配第95页镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

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his

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leu

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thr

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pro·

val

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glu

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C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

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his

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glu

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C肽链CTCGAG基因第96页（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列次序发生改变。

缺失或插入都可造成框移突变

。第97页谷酪蛋丝5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙缬组缬正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引发框移突变第98页-----第99页（三）重排DNA分子内较大片段交换，称为重组或重排。

第100页由基因重排引发两种