克隆文库与系统发育分析

克隆文库构建

与

系统发育分析刘晶静2010-5-21常用分子生物学技术核酸杂交技术

Southernblot杂交

Northernblot杂交

FISHCARD-FISH分子克隆技术

PCR-DGGE-分子克隆技术构建克隆文库T-RFLP…….16SrDNA

克隆文库构建16SrDNA

克隆文库是微生物分子生态学中用来调查环境中原核微生物组成的常用方法之一(MicrobiolRev,1995)突破了用传统的微生物分离纯化的方法调查环境中微生物多样性时很多微生物无法得到纯培养的限制广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查(FEMSMicrobiolEcol,2004)核糖体RNA是蛋白质合成必需的，所以它们广泛存在于所有的原核生物中，并且结构和功能都是保守的；16SrDNA的序列中包括可变区和高变区，因此既可以利用保守区域来设计引物，又可以利用高变区来进行序列间的比对；它们的序列变化比较缓慢而且在原核生物中不发生水平转移，因此16SrDNA

之间序列的差异可以反映不同生物之间的进化关系(AnnuRevMicrobiol,1986)。通过研究基因组中的“biomarker”来研究环境中微生物的多样性的GenBank

http:///

RDPⅡRibosomalDatabaseProjectⅡhttp:///html/1.PCR扩增引物选择消除artifact

chimeria（嵌合体）共扩增造成的嵌合体

heteroduplex（异源双链）序列相近的模板之间退火机率减小PCR的偏好性扩增为减少PCR的循环数和模板浓度，提高延伸时间以及选择适当的DNA聚合酶有利于减少artifact。(ApplEnvironMicrobiol,2001)减少PCR循环数有利于减少PCR偏好性扩增。(FEMSMicrobiolRev,1997)DNA纯化试剂盒/胶回收试剂盒Agrose凝胶电泳验证2.PCR产物纯化粘性末端之间的PCR产物连接。载体具有的氨苄青霉素抗性，所使用的宿主菌DH5α

没有该抗性基因，因此只有带有该质粒的克隆才能在含有氨苄青霉素的平板上生成。pGEM-TEasyVector的图谱3.T载体连接感受态细胞中加入连接产物进行转化；抗生素抗性筛选（转化菌液均匀地涂布于含

Amp、X-gal、IPTG的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。）4.重组DNA的转化与筛选载体还带有lacZ

基因的调控序列和部分结构基因序列，该载体自连以后可以与宿主DH5α基因组上的另一部分lacZ

基因序列产生α互补，在IPTG的诱导下产生有活性的β-半乳糖苷酶并将X-Gal切割成显蓝色的产物。而pGEM-TEasyVector上带有插入片段时会使lacZ

基因失活，当涂布在有IPTG和X-Gal的平板上生长时，就会表现为白色克隆过PCR的方法检查插入片度的大小是否正确载体上插入有16SrDNA

序列的阳性克隆载体引物5.PCR验证为了减少测序的数量，可以先分别用两种不同的核酸内切酶分别对文库进行分型AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysisRestrictionFragmentLengthPolymorphism6.ARDRA/RFLP分型测序反应按序列相似性大于97%（97%-100%都可以）的标准，把所有的测序结果分成若干个OTU（operationaltaxonomicunit）。然后用每个OTU的代表序列在GenBank

和RDPⅡ数据库中进行比对，就可以找到这些OTU相应微生物的系统发育地位，这样就可以知道环境中微生物的组成情况7.克隆测序16SrDNA

克隆文库的库容（librarysize）RarefactioncurveCoverageCSpeciesrichnessShannonIndexSimpsonIndex8.克隆文库分析序列处理软件：SequnecherBLAST比对ClustalXBioEdit

建树软件：MEGA/PAUP/PHYLIP9.系统发育分析系统发育学研究的是进化关系；系统发育分析就是要推断或者评估这些进化关系。序列比对是构建系统发育树、进行系统发育分析的前提和必要条件，目的是建立起所检测序列与其他序列的同源关系,提取系统发育分析数据集系统发育树是表达分类群之间系统发育关系的一种树状图,它可以推测生物类群系统发育的分支样式,给出分支层次或拓扑图形,并能估算类群之间遗传关系的远近。在生物进化研究中,通过构建系统发育树,可以推断个体之间以及群体间的亲缘关系,以及研究对象在系统树中所处的进化地位等。比对建立取代模型建立进化树进化树评估先进行序列比对；再利用比对的结构用合适的算法求出遗传距离；最后再根据遗传距离构建发育树通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表（进化树）来描述，这个进化树就描述了同一谱系的进化关系。距离法（Neighborjoining,NJ）

数据组中所有序列两两对比的结果在系统发育树构建中应用最为广泛,它基于最小进化原理,可以较快的构建系统树,同时也比较适合于分析较大的数据集,并可以很快地进行自展检验。最大简约法（maximumparsimony,MP）

多重比对的结果当序列分歧度较低时,无需模型,源于形态性状的研究最大似然（maximumlikelihood，ML）

多重比对的结果建树的主要方法Jukes-Cantor

模型假定任一位点的核苷酸替代频率都是相同的

Kimura

双参数模型考虑了转换和颠换速率的不同Equal-