基因工程的基本操作程序-公开课-课件

1、1.2 基因工程的基本操作程序11、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定2一、目的基因的获取1.目的基因符合人们需要，能编码蛋白质的基因2.基因文库 P9 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。34种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库5某种生物的全部DNA限制酶DNA片段DNA片段与载体连接重组DNA基因组文库导入受体菌中储存基因组文库的构建6生物某个发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组DNA与载

2、体连接cDNA文库反转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存 cDNA文库的构建-逆转录法： 7基因组DNA文库与cDNA文库的比较83.获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成9依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性（1）从基因文库中获取目的基因10（2）利用PCR技术扩增目的基因 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 原理：_多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制11模板DNA12PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50

3、引物1引物2DNA引物9513PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶14PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始15PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaq16PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束17过程：a、变性（90-95）：双链DNA在受热下，_断裂，形成_b、复性（55-65）：温度降低，引物与单链DNA结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。 氢键单链DNA双链DNA链18

4、方式：以_方式扩增，即_条件：前提条件:_ 结果：指数2n短时间内大量扩增目的基因已知基因的核苷酸序列19DNA复制PCR技术场所解旋方式酶PCR技术扩增与DNA复制的比较高温解旋酶体外复制主要在细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶20（3）人工合成法： 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学合成法 、 反转录法21蛋白质mRNADNA推测推测DNADNA合成仪合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：22二、基因表达载体的构建（核心）1.目的A. 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并遗传给子代B.同时使目的基因能表达和发挥作用232.基因表达载体的组成：

5、a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因24质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA3.基因表达载体的构建过程25（1）用_切割质粒，使其出现切口露出_。（2）用_切割目 的基因，使其产生_ _。（3）将目的基因插入质粒的_处，加入_，形成了一个重组DNA分子限制酶黏性末端同种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同26三、将目的基因导入受体细胞-转化目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程稳定表达受体细胞271、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:a.能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力b.Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上28Ti质粒目

6、的基因构建表达载体导入植物细胞整合植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌29（2）基因枪法-单子叶植物30（3）花粉通道法我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得312、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物323、将目的基因导入微生物细胞（1）方法：Ca2+处理法（增加细胞壁通透性）（2）微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少（3）过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA33四、目的基因的检测与鉴定检测（分子水平）:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:个体生物学水平

7、鉴定34（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA； A 方法:DNA分子杂交 B 过程: 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。1.检测35 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 36(2)检测目的基因是否转录出了mRNA方法:分子杂交法过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。37（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法:抗原-抗体杂交38提取方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养392.鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等40目的基因的表达和检测抗虫鉴定 抗病鉴定活性鉴定等抗原抗体杂交法DNA-RNA分子杂交法DNA分子杂交法受体是否具有转基因特征个体水平目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入分子水平方法检测对象41非编码区非编码区编码区外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核42原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的原核细胞与