凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量-PowerPoint

1、凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量实验目的的掌握凝胶胶层析的的基本原原理。学习利用用凝胶层层析法测测定蛋白白质相对对分子质质量的实实验技能能。实验原理理凝胶层析析法也称称分子筛筛层析法法，是利利用具有有一定孔孔径大小小的多孔孔凝胶作作固定相相的层析析技术。当混合合物随流流动相经经过凝胶胶层析柱柱时，其其中各组组分按其其分子大大小不同同而被分分离的技技术。该该法设备备简单、操作方方便、重重复性好好、样品品回收率率高。凝胶是一一种不带带电的具具有三维维空间的的多孔网网状结构构、呈珠珠状颗粒粒的物质质，每个个颗粒的的细微结结构及筛筛孔的直直径均匀匀一致，像筛子子，小的的分子可可以进入入凝胶网网孔，而而

2、大的分分子则排排阻于颗颗粒之外外。当含含有分子子大小不不一的蛋蛋白质混混合物样样品加到到用此类类凝胶颗颗粒装填填而成的的层析柱柱上时，这些物物质即随随洗脱液液的流动动而发生生移动。大分子子物质沿沿凝胶颗颗粒间隙隙随洗脱脱液移动动，流程程短，移移动速率率快，先先被洗出出层析柱柱；而小小分子物物质可通通过凝胶胶网孔进进入颗粒粒内部，然后再再扩散出出来，故故流程长长，移动动速度慢慢，最后后被洗出出层析柱柱，从而而使样品品中不同同大小的的分子彼彼此获得得分离。若分子子大小介介于上述述完全排排阻或完完全渗入入凝胶的的物质，则居二二者之间间从柱中中流出。总之，各种不不同相对对分子质质量的蛋蛋白质分分子，最

3、最终由于于它们被被排阻和和扩散的的程度不不同，在在凝胶柱柱中所经经过的路路程和时时间也不不同，从从而彼此此可以分分离开来来。如果假定定蛋白质质分子近近于球形形，同时时没有显显著的水水合作用用，则不不同大小小分子量量的蛋白白质，在在洗脱时时峰的位位置和该该物质相相对分子子质量有有直接的的定量的的关系。在一根根凝胶柱柱中，凝凝胶颗粒粒间空隙隙所含水水相体积积为外水水体积V，不不能进入入凝胶孔孔径的那那些大分分子，当当洗脱体体积为时时V，出现洗洗脱峰。凝胶颗粒粒内部孔孔穴的总总体积为为内水体体积Vi，能全全部渗入入凝胶的的那些小小分子，当洗脱脱体积为为V+Vi时时，出现现洗脱峰峰。利用Andrews

4、的的实验经经验式：lgMr =a/bVe/bVo式中，Ve为洗洗脱体积积。它是是自加样样品开始始到该组组分的洗洗脱峰（峰顶）出现时时所流出出的体积积。Vo为外水水体积，Mr为为相对分分子质量量，a和和b为常常数。葡聚糖凝凝胶有不不同的型型号，用用于分离离不同相相对分子子质量大大小的物物质。例例如SephardexG-75的分级级范围是是3000-80000的球球形分子子。在本本实验中中用于分分离胰岛岛素（Mr为6000）和牛牛血清蛋蛋白（Mr75000）。仪器和试试剂仪器：层层析柱、恒流泵泵、紫外外检测仪仪、自动动部分收收集器试剂待测样品品：胰岛岛素、牛牛血清白白蛋白蓝色葡聚聚糖2000；Se

5、phardex G-75；洗脱剂剂实验步骤骤1凝胶胶溶胀凝胶颗粒粒要求大大小比较较均匀，可流流速稳定定，结果果较好。取葡聚糖糖Sephardex G-75干干粉，加加过量的的蒸馏水水室温充充分溶胀胀一天（溶胀时时间因凝凝胶交联联度不同同而不同同），或或沸水浴浴中溶胀胀3小时时，这样样可大大大缩短溶溶胀时间间，而且且可以杀杀死细菌菌和霉菌菌，并可可排出凝凝胶内气气泡。溶溶胀过程程中注意意不要过过分搅拌拌，以防防颗粒破破碎。待待溶胀平平衡后用用倾泻法法除去不不易沉下下的细小小颗粒，最后凝凝胶经减减压抽气气除去气气泡，即即可准备备装柱。2.装装柱与与平衡装柱前须须将凝胶胶上面过过多的溶溶液倾出出，将

6、层层析柱垂垂直装好好。关闭闭出口，向柱管管内加入入约1/3柱容容积的洗洗脱液，然后在在搅拌下下，将浓浓浆状的的凝胶连连续地倾倾入柱中中，使之之自然沉沉降，待待凝胶沉沉降约23cm后，打开柱柱的出口口，调节节合适的的流速，使凝胶胶继续沉沉集，待待沉集的的胶面上上升到离离柱的顶顶端约5cm处处时停止止装柱，关闭出出水口。装柱要要求连续续、均匀匀、无气气泡、无无“纹路路”。将洗脱剂剂与恒流流泵相连连，恒流流泵出口口端与层层析柱相相连。通通过23倍柱柱床容积积的洗脱脱液使柱柱床平衡衡，然后后在凝胶胶表面上上放一片片滤纸或或尼龙滤滤布，以以防将来来在加样样时凝胶胶被冲起起，并始始终保持持凝胶上上端有一一

7、段液体体。3.上上样与与洗脱样品上柱柱是实验验成败的的关键之之一，若若样品稀稀释或上上柱不均均，会使使区带扩扩散，影影响层析析效果。上样时时应尽量量保持床床面的稳稳定。先先打开柱柱的出口口，待柱柱中洗脱脱液流至至距床表表面12mm时，关关闭出口口，用滴滴管将1ml样样品慢慢慢地加至至柱床表表面，应应避免将将床面凝凝胶冲起起，打开开出口并并开始计计算流出出体积，当样品品滲入床床中接近近床表面面1mm时关闭闭出口。按加样样操作，用少量量（约1ml）洗脱液液冲洗管管壁2次次。最后后加入少少量洗脱脱液于凝凝胶上，使高出出床表面面35cm，旋紧上上口螺丝丝帽，柱柱进水口口连通恒恒流泵，调好流流速，以以每

8、管3ml/10min流流速开始始洗脱。上样的的体积，分析用用量为柱柱床容积积的12%；制备用用量为柱柱床容积积的20%30%。4.收收集与鉴鉴定用自动部部分收集集器收集集流出液液，每管管4ml，紫外外检测仪仪280nm波波长处检检测，最最高的一一个OD值时的的体积即即为吸收收峰的洗洗脱体积积Ve。5凝胶胶柱的处处理凝胶用过过后，反反复用蒸蒸馏水洗洗后保存存，如果果有颜色色或比较较脏，可可用0.5mol/LNaCl洗涤涤。短期期可保存存在水相相中，加加入防腐腐剂或加加热灭菌菌后于低低温保存存。建议议长期用用干燥状状态保存存。计算 分子量的的测定和和计算，一般都都采用标标准曲线线法。只只要测得得几

9、种标标准蛋白白质相对对分子质质量的Ve，并并以它们们的相对对分子质质量的对对数(logMr)对对Ve作作图得一一直线，再测出出待测样样品的Ve，即即可从图图中确定定它的相相对分子子质量。注意事项项各接头不不能漏气气，连续续用的小小乳胶管管不要有有破损，否则造造成漏气气、漏液液。注意意恒压瓶瓶内的排排气管应应无液体体，并随随着柱下下口溶液液的流出出不断有有气泡产产生，则则表示恒恒压瓶不不漏气。操作过过程中，层析柱柱内液面面不断下下降，则则表示整整个系统统有漏气气之处，应仔细细检查并并加以纠纠正。始终保持持柱内液液面高于于凝胶表表面，否否则水分分挥发，凝胶变变干。也也要防止止液体流流干，使使凝胶混混入大量量气泡，影响液液体在柱柱内的流流动，导导致分离离效果变变坏，不