遗传病的诊断-01医学医药课件

1、遗传病的诊断Diagnosis of genetic disease遗传病的诊断Diagnosis of genetic dis 临 症 诊 断 Whatwewillstudy？Segment 2 Segment 1症 状 前 诊 断Segment 3 出 生 前 诊 断 临 症 诊 断Whatwewillstudy？SegmenSegment 1临症诊断 是医务工作者根据已经出现症状的患者和各种临床表现进行分析，并进行疾病的诊断和遗传方式的判断。 病 史 采 集家族史：双方家族成员中有无遗传病史。婚姻史：是否属于近亲婚配，婚龄，婚次，配偶健康状况，生活习惯等。生育史：生育年龄，胎次，孕期病史

2、，有无流产史、死产、早产、难产、产程情况，有无接触过有毒物质或电力辐射。1. 病史、症状和体征临 症 诊 断Segment 1临症诊断 是医务工作者根据已经出现症状的例智力低下黄疸白内障肝脾肿大智力发育不全毛发黄腐臭味苯丙酮尿症 ？半乳糖血症 ？?面似满月生长缓慢哭声象猫叫猫叫综合症 ？?症状与体征例智力低下智力发育不全苯丙酮尿症 ？半乳糖血症 ？?面似满2. 系 谱 分 析系谱分析（pedigree analysis)从先证者入手，尽可能多地调查其亲属的患病情况。这有助于遗传病与非遗传病的区别、单基因病与多基因病的区别。建立系谱时的注意事项：主诉的完整性；特殊情况的存在；症状和体征检查的完整

3、性；遗传异质性的存在；不完全外显与延迟外显的存在；遗传印记以及动态突变的存在等。2. 系 谱 分 析系谱分析（pedigree analys遗 传 病 诊 断 中 的 注 意 事 项孟德尔式遗传病 是指符合孟德尔式遗传特征，通常为单基因病。被分为AD、AR、XD、XR和Y连锁遗传等几种类型。系谱分析对这类疾病的分析十分有用，但要注意遗传异质性、外显不全以及延迟显性等造成的临床假象。非孟德尔式遗传病 包括线粒体病和多基因病。线粒体基因突变所致的遗传病是母系遗传,主要表现为晚发,并进行性加重。多基病是常见疾病，有家族聚集现象，但非孟德尔遗传。具有特殊遗传方式的疾病1.遗传印记2.动态突变遗 传 病

4、 诊 断 中 的 注 意 事 项孟德尔式遗传病 染色体荧光原位杂交(FISH)性染色质检查染色体检查 核型分析3. 细胞遗传学检查染色体荧光原位杂交(FISH)性染色质检查染色体检查 谁 应 进 行 染 色 体 检 查 ?智力发育不全生长迟缓或伴有其他先天畸形者；夫妇中有染色体异常如平衡易位，嵌合体等；家族中已发现染色体异常或先天畸形个体；多发性流产的妇女及其丈夫；原发性闭经和男女不孕症者；34岁以上的高龄孕妇；有两性内外生殖器畸形者。谁 应 进 行 染 色 体 检 查 ?智力发育不全生长迟缓或染 色 体 检 查染 色 体 检 查性 染 色 质 检 查X小体Y小体推测核型 ？ 疾 病02100

5、01245,XO47,XXY47,XYY性腺发育不全症XXX性腺发育不全症先天性睾丸发育不全症XYY型综合症 12 48,XXYY47,XXXXXYY型综合症 性 染 色 质 检 查X小体Y小体推测核型 ？ 疾 病X染色体Y染色体13号染色体18号染色体21号染色体X染色体Y染色体13号染色体18号染色体21号染色体13号染色体21号染色体13号染色体21号染色体4. 生 化 检 查 疾病名称 检查的酶 材料 白化病 酪氨酸酶 毛囊 苯丙酮尿症 苯丙酮氨酸羟化酶 肝 半乳糖血症 半乳糖磷酸尿苷转移酶 红细胞 DMD 肌酸磷酸激酶 血清 该方法适用于分子病，先天性代谢缺陷等遗传病。4. 生 化

6、检 查 疾病名称 检查的酶 5.基因诊断 运用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而作出或辅助临床诊断的技术，称为分子诊断，又叫基因诊断。基因诊断的材料包括：DNA，RNA与蛋白质。5.基因诊断 运用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的基因诊断的基本原理基因诊断的基本途径基因诊断的常用技术 Southern 印迹杂交 聚合酶链反应 多态性连锁分析 单链构象多态性基因诊断的基本原理加热加碱变性缓慢降温复性或退火基因诊断原理加热变性缓慢复性基因诊断原理基因诊断的基本途径直接诊断 是直接检测致病基因本身的异常，适用于已知基因异常的疾病诊断。2.间接诊断 当致病基因已知而异常未知时

7、，或致病基因也未知，可通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带致病基因的染色体。基因诊断的基本途径直接诊断核苷酸探针（nucleic acid probe)或基因探针是指一段被标记了的、特定的核苷酸序列(DNA/RNA)，用于杂交筛查鉴定被测DNA或RNA分子。基因探针种类1.基因组DNA探针2.cDNA探针3.寡核苷酸探针4.RNA探针探针的特性1.应带有标记2.应用探针应为单链3.具有高度特异性4.探针的序列应选择基因编码序列一、分子杂交相关技术核苷酸探针（nucleic acid probe)基因探针种探针标记物标记探针靶核酸杂交体探针标记物标记探针靶核酸杂交体限制性核酸

8、内切酶 限制性核酸内切酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点或切点。限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：1.是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端；2.为平整切割，即两条链在同一水平切开，得到平齐末端。 5GAATTC33CTTAAG5EcoR 5GGCC33CGCG5HaeIII限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能特异地识别和切割 每个人的DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一个是不相同的，

9、即多态性。碱基的变异就可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。 RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。 RFLP (restriction fragment length polymorphism) 每个人的DNA是不完全相同的，一般每100500b 等位基因2由于出现新的切点，

10、DNA片段缩至8kb。 DNA片段电泳后杂交图等位基因2探针位置12kb8kb8Kb4Kb等位基因1探针位置 等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb。 DN分子杂交的基本过程待侧核酸的制备待侧核酸滤膜固定预 杂 交制备探针探针标记加入标记探针杂 交去除剩余探针检测杂交信号分子杂交的基本过程待侧核酸的制备待侧核酸滤膜固定预 杂 交制1. Southern Blot1.基因组DNA2.用限制酶消化3.凝胶电泳分离变性5.探针杂交6.放射自显影4.滤膜转印DNA Southern Blot 是指将待测核酸分子结合到一定的固相支持物上的方法。1. Southern Blot1.基因组DNA2

11、.用限制例1 直接分析法镰状细胞贫血(HbS)： 第57位密码子AA AS SSMst: CCTNAGG 1.2 Kb 0.2Kb1.40 Kb1.20 Kb0.20 KbA: CCTGAGGAGS: CCTGTGGAG例1 直接分析法镰状细胞贫血(HbS)： 第5例2 Bgl酶对一血友病家系的RFLP分析II 1 2 3 4 5 6 7 1 2 5/5 5/- 5/5 5/20 5/- 5/20 20/- 5/- 20/- 5kb20kb例2 Bgl酶对一血友病家系的RFLP分析II 例3 RFLP连锁分析Neurofibroma, NF1RFLP1 21 2 3 4 5 6 7 81 2

12、3 4 5 6 7 84.7 kb3.0 kb例3 RFLP连锁分析Neurofibroma, NF15.6 Kb5.2 Kb4.2 Kb4.0 KbHind PKU，AR1 21 2 3Sph11.0 Kb 9.7 Kb 7.0 Kb例4 单体型分析5.6 KbHind PKU，AR1 21 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（ASO）用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱

13、基发生了突变的基因区别开来。 2. ASO（allele-specific oligonucleotide） 当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因ASO斑点杂交1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸探针进行基因诊断。正常探针突变探针PKU，ARASO斑点杂交1986年，胡流清等基于点突变原理，用寡核苷酸PCR是一项在模板、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP、适宜的温度变化等条件下，按照变性、复性、引物延伸，循环往复20 40个周期，体外快速合成扩增DNA的技术。高温低温退火中温模板DNA引物与模板结合引物延伸周期1周期2变性二、聚合酶链反应（PCR）相关技术PCR是一项在

14、模板、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP、适宜的 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） PCR原理 聚合酶链反应PCR原理PCR原理变性PCR原理变性PCR原理复性PCR原理复性PCR原理延伸PCR原理延伸PCR原理变性PCR原理变性PCR原理复性PCR原理复性PCR原理延伸PCR原理延伸PCR原理变性PCR原理变性PCR原理复性PCR原理复性PCR原理延伸PCR原理延伸 DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。长片段（单链）2401625611452228200短片段（单链）141210864

15、2128643216总片段（单链）循环数 DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩预变性(92-95C,2-5m)变性(92-95C,30s)复性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)总延伸(72C,7m)(25-35)PCR的一般过程：经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。预变性(92-95C,2-5m)变性(92-95C,30 1.2 kb 0.2 kb镰状细胞贫血(HbS)： 第57位密码子Mst: CCTNAGGA: CCTGAGGAGS: CCTGTGGAGPCR-RFLP 1.2 kb PCR-RFLPPCR-RFLPSSCP技术对照DN

16、A被检DNA 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。SSCP技术对照DNA被检DNA 单链DNA片段呈复杂的PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR产物单链DNA凝胶电泳技术。1 2 3 4 5a b1：正常人 2,4,5：纯合体患者 3：杂合体(2的弟弟)左为泳动变位模式：a 正常人；b 纯合体患者PCR-SSCP1989年，Orita等建立的PCR产物单链GAAGAGTGTTATCTCCACPCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCACPCR-S

17、SCP 在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每个重复单位通常只有几几十个碱基对，但其重复次数在人群中是高度变异的，又叫数目变异的串联重复（variable number tandem repeats,VNTR）。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段，可用于致病基因的连锁分析。探针酶切后电泳VNTR 在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫IV 1 2I 1 2 III 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11II 1 2 3 4 5 6454144424630例如：延迟显性遗传病的诊断正常人IT1

18、5基因 (CAG)n 26 表型正常前突变个体 27(CAG)n 35 不完全外显个体 26(CAG)n 39 完全外显患者 (CAG)n 40Segment 2 症状前诊断IV 1 出生前诊断Segment 3 对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形做出的诊断称为产前诊断，又叫宫内诊断。出生前诊断Segment 3 对胚胎或胎儿在出生前是产前诊断的对象年龄在三十五岁以上的高龄孕妇；曾生育过染色体异常的患儿的夫妇；夫妇一方有染色体数目或结构异常者；有先天性代谢缺陷或生育过此类患儿的夫妇；夫妇一方为严重性连锁隐性遗传病携带者；生育过多发畸形患儿的夫妇；有原因不明的多发流产、死产或死胎的夫妇；有明显致畸因素接触史的夫妇；？产前诊断的对象年龄在三十五岁以上的高龄孕妇；？一、创伤性方法：包括羊膜穿刺、绒毛取样、脐周血取样、胎儿镜和胚胎火检等；二、非创伤性方法：包括超声扫描、X线检查、母体外周血胎儿细胞检测等；?产前诊断的方法分类 一、创伤性方法：包括羊膜穿刺、绒毛取样、脐周血取样、胎儿镜和诊断技术获取羊水中胎儿细胞及成分，进行细胞遗传学、分子生物学、生化学检测等；超声波检查绒毛吸取术X线检查胎儿镜检查羊膜穿刺术使用范