飞扬草提取黄酮

1、飞扬草总黄酮量提取工艺及抗氧化性研究摘要采用乙醇浸提法研究飞扬草总黄酮类物质的提取工艺及其抗氧化性能。探讨了单因素对总黄 酮含量提取的影响，并采用了正交实验优化总黄酮提取最佳的工艺条件。结果表明，最佳提取参数为：提 取温度为70C，时间为3h,料液比1:20（g:ml）,乙醇浓度为60%。在此条件下测得总黄酮含量为56.650mg/g, 提取物对羟自由基具有较好的清除效果。关键词飞扬草；总黄酮；提取工艺；自由基的清除率前言飞扬草为一年 生草本，高20-50厘米，全体有乳汁；茎基部膝曲状向上 斜升，近 基部分枝，枝被粗毛，在上部的毛更密。叶为单叶，对生，披针状长圆形或长圆状卵 形，长1-3厘米，

2、宽0.5-1.3厘米，顶端急尖或钝，基部偏 斜，不对称，边缘有细锯 齿，稀全缘，两面被柔毛，背面及沿脉上的毛 较密，叶柄长1-2毫米，托叶膜质， 披针形或线状披针形，边缘刚毛状撕裂，早落。夏季及秋季开淡绿色或紫色小花；杯状聚伞花序再排成紧密的腋生头状花序；总苞钟状，外面密生短柔毛，顶端 4-5裂； 腺体4枚，漏斗状，有短柄及花瓣状附属物。雄花多数，每一雄花仅具1雄蕊，雌花 单生于总苞的中央，仅有一个3室的子房和花柱3枚。蒴果卵状三棱形，长1.5毫米， 被贴伏的柔毛；种子卵状四棱形，每面有多少明显的横沟。可用于医药，治疗急性肠 炎及菌痢，治疗慢性气管炎。生于向阳山坡、山谷、路旁和灌木丛下，多见

3、于砂质土上或村边。分布于我 省 及广西、云南、湖南、江西、福建、台湾等省区。日本、菲律宾、印度尼西亚、印度 等热带与亚热带地区亦有分布。实验部分2.1试剂和仪器飞扬草（采自泉州师范学院山顶公）；芦丁（中国药品生物制品检定所）；亚硝酸钠AR （上海联试化工试剂有限公司）；硝酸铝AR（天津市水大化学试剂开发中心）；氢氧化钠AR （上海联试化工试剂有限公司经销）；七水合硫酸亚铁（汕头市西陇化工有限公司）；3%双氧 水（上海联试化工试剂有限公司）；水杨酸（天津市化工研究所）；无水乙醇AR （西陇化工 股份有限公司）；蒸馏水。SHB-m循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；721E型可见分光光度

4、计（上海 光谱仪器有限公司）；CH1015超级恒温槽（上海衡平仪器仪表厂）；DHG-9076A电热恒温鼓风 干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；食物 粉碎机（九阳A100）2.2原料的预处理：飞扬草探摘到实验室去杂后，用日晒进行杀青，并用60r的温度对其进行烘干，然后 进行粉碎，过40目筛，保存于广口瓶中待用。2.3提取工艺过程飞扬草f洗净杀青烘干f粉碎f过40目乙醇加热浸取f冷却后抽滤f飞扬草黄酮提 取物2.4总黄酮含量的测定2.4.1波长的选择取样品液适量，在0.30mL 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试 剂为空白参比液在42

5、0一700nm波长范围测定络合物的吸光度，络合物于510nm波长处有最大 吸收，故测定时选用此波长。2.4.2总黄酮测定方法由于黄酮类物质能与铝离子生成紫红色络合物，以蒸馏水为空白组，采用可见分光光度 计测定其含量。准确称取飞扬草1.00g，按照实验条件进行浸提，再对浸提后的样品进行冷却抽滤，得 到滤液，将滤液与乙醇溶液进行定容于50mL的容量瓶中，再从中准确量取1mL的提取液于 10mL的容量瓶，向其加入0.3mL 5%的NaNO2溶液，静置3min，再从中加入0.3mL 10%的 Al （NO3溶液静置3min，最后加入4mlNaOH溶液静置6min，在510nm处测其吸光度A。2.4.

6、3标准工作曲线的制作用移液管分别准确吸取0.10 mg/mL的芦丁对照液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、 5.00mL于10.00 mL容量瓶中，分别加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min； 再加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；再加入4.00 mL 4%氢氧化钠 溶液，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置12 min，以试剂作空白，于510nm处测吸光度。 吸光度测定结果下表。表1芦丁标准样的吸光度Table 1 The absorbance of rutin standard sample浓度（mg/mL）0.0

7、00.010.020.030.040.05吸光度/A0.0000.0840.1710.2500.3250.4010.4553 OO3 0.4553 OO3 O5 0 52 2 - o o O *光吸0.100.050.00 L0.00浓度 /(mg/mL)图1标准曲线Figure 1 Standard curve2.5提取液总黄酮浓度的计算：根据实验方法，将实验测得的吸光度A数值代入回归方程A=0.00377+8.04266X, r=0.9996。 中，求出其X值，所得即为显色后总黄酮的浓度C1（mg/mL）。定容后浸提液中总黄酮 M = C1 x 10 x 50，其单位mg，这个即为1.00

8、g含有的总黄酮量M（mg）。2.6影响提取工艺效果的因素试验2.6.1单因素试验设计方案：由于各因素之间的相互影响，主要对浸提温度、乙醇浓度、时间和料液比进行研究。2. 6.2正交试验设计方案：以单因素试验较优结果为依据，设计乙醇浓度、提取时间、料液比、浸提温度四因素三 水平的正交试验，以获取最佳提取工艺相应参数。结果与分析3.1乙醇浓度对提取率的影响分别用不同浓度的乙醇（40%,50%,60%,70%,80%），在提取温度为60C，料液比为 1:10，提取时间120min的条件下，乙醇浓度对飞扬草中总黄酮类物质的提取量的影响下图所 示，由图可得：随着乙醇浓度的提高，黄酮类物质的提取量先增加后

9、减小，在乙醇浓度为70% 时出现峰值。乙醇作为浸提溶剂的较适浓度范围为60% 80%，所以选择乙醇浓度60%、 70%、80%作为本正交试验的较优水准。表2不同乙醇浓度对黄酮提取的影响Table 2Effects of ethanol concentration on extracting rate of flavonoids乙醇浓度/%4050607080吸光度/A0.6090.6700.7120.7620.692黄酮含量/ （mg/g)37.62641.41844.02947.13842.786图2乙醇浓度对黄酮提取影响Figure 2 Effect of ethanol concentr

10、ation on the content of flavonoids3.2不同料液比对黄酮提取的影响分别用不同料液比（1： 5、1： 10、1： 15、1： 20、1： 25），在提取温度为60C，乙醇 浓度为70%,提取时间90min的条件下，不同料液比对飞扬草中总黄酮类物质的提取量的影响 下图所示，由图可得：随着料液比的提高，黄酮类物质的提取量先增加后减小，在料液比为 1： 20时出现了最大值。所以选择料液比1： 15, 1： 20, 1： 25作为本正交试验的较优水准。表3料液比对黄酮提取的影响Table 3 Effects of extracting water dosage on e

11、xtracting rate of flavonoids料液比 （g： mL）1:51： 101:151:201:25吸光度/A0.6020.6550.7140.7300.608黄酮含量/ （mg/g37.19140.48644.15445.18937.564图3料液比对黄酮提取影响Figure 3 Effect of the ratio of material weight on the content of flavonoids3.3不同提取时间对黄酮提取的影响在提取温度为60C，乙醇浓度70%,料液比为1:10，提取时间分别为(60min、90min、 120min、150min、180

12、min)的条件下，提取时间对飞扬草中总黄酮类物质的提取量的影响下 图所示，由图可得：随着提取时间的提高，总黄酮类物质的提取量先增加后减小，在提取时 间为120min时最大值。所以选择提取时间为120min、150min、180min作为本正交试验的较优 水准。表4不同提取时间对黄酮提取的影响Table 4 Effects of time on extracting rate of flavonoids时间/min6090120150180吸光度/A0.6850.7160.7510.7970.701黄酮含量/ (mg/g)42.35044.27846.45449.31443.346图4提取时间对

13、黄酮提取影响Figure 4 Effect of the extracting on the content of flavonoids3.4不同温度对黄酮提取的影响在乙醇浓度70%,料液比为1:10,提取时间为90min,提取温度分别为（40C、50C、60C、 70C、80C）,的条件下，不同温度对飞扬草中总黄酮类物质的提取量的影响下图所示，由 图可得：随着提取温度的提高，总黄酮类物质的提取量先增加后减小，在提取温度为70C时 最大值。所以选择提取时间为60C、70C、80C作为本正交试验的较优水准。表5不同温度对黄酮提取的影响Table 5 Effects of temperature

14、on extracting rate of flavonoids温度尸C4050607080吸光度/A0.6150.6450.6840.6970.648黄酮含量/ （mg/g）37.99939.86442.28943.09740.051图5温度对黄酮含量的影响Figure 5 Effect of extracting temperature on the content of flavonoids3.5总黄酮提取最佳工艺最佳条件由上面单因素试验可知，总黄酮物质的提取乙醇浓度、料液比、提取时间、温度四个因 素对总黄酮类的提取率均具有很大的影响。为了对总黄酮提取工艺条件进行优化选择正交试 验，其实

15、验因素水平表和正交试验结果见下表。表6因素水平表Table 6 Factors and level编号A（乙醇浓度/%）B（温度/ C）C（时间/min）D（料液比/ （g:mL）160601201： 20380801801： 25正交实验数据见表七，由表七数据可知：不同因素对总黄酮提取影响的大小顺序是：时 间料液比乙醇浓度温度，即提取总黄酮的最佳工艺条件是：提取时间180min，料液比1:20,乙醇浓度60%,提取温度70C。表7正交试验数据Table 7 Orthogonal test编号ABCD总黄酮含量/(mg/g)1111149.6872122257.831

16、3133357.5214212349.7495223154.9716231247.6357313251.6148321346.7659332149.376K1165.039151.05144.087154.034K2152.355159.567156.956157.080K3147.755154.532164.106154.035k155.01350.35048.02951.345k250.78553.18952.31952.360k349.25251.51154.70251.345R5.7612.8396.6731.0153.6最佳条件的三组验证试验在上述提取时间180min，料液比1:20

17、,乙醇浓度60%,提取温度70C的最佳条件下，进行三组平行实验，用于考察最佳条件的可靠性和合理性，由下表可知总黄酮平均提取量为 56.650mg，相对于正交试验结果中的每一组总黄酮提取量高，比较符合实际结果。表8最佳工艺条件的验证结果Table 8The verification results of the optimum extraction process吸光度/A0.9320.8980.915黄酮含量/ (mg/g) 平均值/ (mg/g)57.70755.59356.65056.6503.7抗氧化性的研究(对羟基自由基的清除)参照Fenton反应的方法建立反应体系模型，我们可以利用H

18、2O2和Fe2+混合反应产 生OH，但是因为OH很不稳定,存在的时间短，如果可以在反应体系中加入水杨酸，就能有 效地捕捉OH,并且产物是有色产物。反应式如下：H2O2 + Fe2+ Fe3+ OH +OH-该产物在510nm处有很强吸收，如果在该反应体系中加入可以清除QH功能的被测物， 就会与水杨酸竞争并且夺取PH,从而可以使有色产物生成量减少，用固定反应时间法且在相 同体积的反应体系(该反应体系：8.8 mmol/L H202 1mL,9 mmol/LFe2+ lmL,9 mmol/L 1mL 水 杨酸一乙醇溶液)再加入一系列不同浓度的飞扬草提取液，并且以蒸馏水为参比液，在 510nm处的条

19、件下测量各浓度下的吸光度，便能计算出被测物(总黄酮)对OH的清除作 用。抗氧化性：在10ml的容量瓶中依次加入9mmol/L的硫酸亚铁，8.8mmol/L双氧水， 9mmol/L的水杨酸一乙醇溶液各1ml,加蒸馏水定容，并在37C的超级恒温槽恒温15分钟， 取出在510nm处测吸光度A。取5个同样为10ml的容量瓶，依次分别加入9mmol/L的硫酸 亚铁，8.8mmol/L双氧水，9mmol/L的水杨酸一乙醇溶液各1ml，再分别加入0.5、1、1.5、 2、2.5 ml的飞扬草提取液，加蒸馏水定容至10 ml，在37C恒温15分钟，在510nm处测 吸光度A。清除率=(A-A)/A*100%

20、X0 X 0本实验所用黄铜实验采用提取液黄酮含量为54.971mg/g。由下图得回归方程： Y=-0.247+84.82727*X， R=0.99979表9飞扬草黄酮对羟自由基的清除效果9Table 8 The relationship between Euphorbia hirta and free radical scavenging体积/mL00.511.522.5黄酮浓度/ (mg/mL )00.1100.2200.3300.4400.550Ax/A0.9350.8420.7620.6710.5830.495清除率/%/9.9518.4828.1437.5747.06图6提取物对自由基

21、的清除效果Fig.6 Extraction to free radical elimination effec本文探讨了乙醇浸提方法提取飞扬草黄酮类化合物的最佳工艺条件。在单因素实验的 基础上的正交试验结果：飞扬草黄酮类化合物乙醇法提取的各实验因素对提取率的影响大小 依次是 时间料液比乙醇浓度温度，既是提取总黄酮的最佳工艺条件是：提取时间 180min，提取温度70C，料液比1:20,乙醇浓度60%。这种提取工艺可使飞扬草黄酮类化合物的提取量达56.650mg/g。对飞扬草黄酮类化合物的抗氧化性进行研究，其结果表明飞扬草黄酮类化合物具有较好 的羟基清除作用。本项研究为飞扬草黄酮类化合物的开发利

22、用提供科学依据。参考文献：苗建英.银杏叶中黄酮类化合物提取工艺研究J.中成药,2006,28 (7) :1060-1061.黄锁义，黎海妮，余美料等.益母草总黄酮的提取及鉴别J.时珍国医国药，2005,16 (5) : 398-399.李苑，张敏.中草药中黄酮类化合物提取工艺的研究概况J.广东药学,1999 (9) :46.宫玉婷，王钰,阿不都拉阿巴斯.梓树果实中黄酮类化合物提取工艺研究J.食品科学,2008， 29(04):193-195.王兰珍，马希汉，王姝清,王性炎.元宝枫叶总黄酮提取方法研究J.西北林学院学报,1997 (4) :64671曹纬国，刘志勤，邵云等.黄酮类化合物药理作用的

23、研究进展J.西北植物学报，2003, 23 (12)： 2241-2247.李瑞光，刘邻渭，郑海燕等.芦苇黄酮提取液体外抗氧化特性研究J.西北农业学报，2009,18 (4) :310-314.许钢，张虹.大麦麦叶中黄酮类化合物清除自由基动态研究J.营养学报，2003 ,25 (4 )401-404.LI R，CHEN Y L，SHI T. Flora of China (中国植物志)M. Vol.74， Beijing： Science Press， 1985： 295.戴余军，江德安.银杏叶总黄酮水浸提法的研究.安徽农业科学J，2008, 36(1):20-21，25.Study on total flavone content and antioxidant activity ethanol extraction from Euphorbia hirtaChemistry and life sciences college , 08 Chemical engineering and technology,081007026,Me