大规模动物细胞培养技术课件

1、大规模动物细胞培养技术 Sartorius BBI Systems (B.Braun Biotech International GmbH)德国赛多利斯BBI系统（贝朗国际生物）sdsdsdsThe Cellbacterial cellmammalian cellCellwallRibosomeCytoplasmGenomePlasma membraneRibosomeCytoplasmNucleusMitochondrionGolgi apparatusEndoplasmic Reticulum细菌与细胞的结构大规模细胞培养需要解决的问题工艺优化：温度，pH，O2，营养成分（葡萄糖、谷胺酰胺

2、）动态补料工艺、培养基成份的优化 排除代谢废物：氨、乳酸、CO2，细胞碎片，死细胞防止染菌：接种、补料、取样、收获 解决剪切力问题：低剪切力搅拌，无泡通气复杂的过程监控：溶氧：搅拌，Air, O2, N2 级联控制 pH ：CO2，补料（Na2HCO3）级联控制 补料：液位，收获级联控制接种：无菌输送营养成份杂交瘤细胞培养时使用的血清中的各种蛋白是单抗纯化的主要障碍杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEMF12，DMEMF12RPMI 1640无血清培养基用于杂交瘤细胞培养

3、有它的固有优点，也有它的不可避免的缺点，如需要对每个细胞系优化配方， 添加成本很高的激素和生长因子，导致长的迟滞期，降低细胞生长速率、最大细胞密度和细胞活性等 逐渐形成了以胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠为基础添加剂的各种无血清培养基配方，进而通过合理解决铁离子的传递问题，开发出了无蛋白培养基 胰岛素是杂交瘤细胞的重要生长因子，能够刺激葡萄糖的利用及RNA、蛋白和磷脂的合成 转铁蛋白是一种结合铁的糖蛋白，在无血清培养基中是一种重要的生长刺激蛋白 乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，与细胞内的磷脂合成有关 亚硒酸钠中的硒作为一种微量元素，是一种谷胱甘肽过氧化物酶的辅因子，拥有抗过氧化物的能

4、力，因而可提高杂交瘤细胞在无血清培养基中的生长速率及活性 多数细胞系需要脂类维持在无血清培养基中生存，常见的添加脂类为胆固醇、低密度脂蛋白、大豆磷脂和亚油酸或油酸 所需微量元素：铁、硒、铜、铝、锰、钒、锌等；无蛋白条件下长期培养往往还需要添加铷、锆、铬、镉、钴、镍、硅、锡、锗等 无血清培养基中常见的其他添加物质包括：-巯基乙醇、氢化可的松、维生素C、生长因子和抗氧化剂等 营养成份其他需要注意的要点提高培养细胞的接种密度；选择合适的抗流体剪切保护剂，在含血清培养时选用的保护剂未必在无血清培养时适用；选择合适的生物反应器，使剪切作用更小，控制精度更高；添加更丰富的氨基酸和维生素；定期检查杂交瘤细胞

5、的遗传特性，特别是分泌单抗能力的变化，必要时进行重新克隆或用新的种子；建立液氮冻存细胞的方法和程序；细胞培养用的容器要更加洁净，水和化学品的纯度要更高；培养基的储存期要短，储存时应避免反复冷冻或pH的大幅度波动。 剪切力对动物细胞的作用及细胞保护 在生物反应器中，机械搅拌和气泡都会给杂交瘤细胞带来损伤，降低细胞活性 最为严重的是，在培养基中运动的气泡常会吸附大量细胞于气液界面，在其运动特别是聚并和破碎时，会严重破坏细胞，造成对细胞活性的严重影响 通常血清对细胞有较好的保护作用，表面活性物质，如Pluronic F68，通过阻止细胞在气泡表面的吸附，从而达到保护细胞免受气泡损伤的目的。其它的一些

6、大分子聚合物也对细胞有一定的保护作用。但Pluronic F68这类保护剂对某些细胞的生长有抑制作用对反应器而言，解决的方案是：1、采用低剪切力的搅拌桨；2、采用无泡通气系统或者在大反应器中采用微泡通气系统。 能源和碳源物质的利用和有害副产物的形成 杂交瘤细胞生长的主要能源物质和碳源物质是葡萄糖和谷氨酸胺。 由于杂交瘤细胞不正常的代谢途径，葡萄糖通常经过糖酵解过程转化为丙酮酸，然后还原为乳酸，一般培养基中5080% 的葡萄糖转化为乳酸，而乳酸对细胞生长和抗体合成有一定的抑制作用，特别是会引起培养基pH值的下降。高的葡萄糖浓度常会造成乳酸的快速积累 ，所以采用流加或补加葡萄糖的方法可降低乳酸的积

7、累 谷氨酰胺本身是一种很不稳定的氨基酸，它在培养基中可化学分解为吡咯烷酮羧酸和氨。在细胞代谢过程中，谷氨酰胺也产生大量的氨和乳酸 。氨对杂交瘤细胞有较强的毒害作用。通常采用谷氨酰胺浓度限制的方法降低氨的生成或采用各种方法从培养基中除去氨。 由于糖酵解和谷氨酰胺代谢遵循不同的途径，因此培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的比例也必须调整到一个合适的值。需要摸索不同生长期和表达期对葡萄糖和谷胺酰胺的不同需求量。对反应器而言，为了避免葡萄糖和谷胺酰胺在代谢过程中产生的副作用，必须要配有高效率的灌注系统，一边把代谢废物排出反应器，一边把新鲜营养成份补充进来。可以配备生化分析仪在线检测这些代谢产物的浓度，跟进分析仪

8、的分析结果对反应器内进行动态的补料。所以，如果和生化分析仪关联控制的话，需要反应器的控制系统有很强的编程控制功能。 反应器罐体设计高径比：2：1（搅拌速度较低，需要混合均匀）所有需要配备的接口：搅拌马达轴封、进排气口、接种口、电极插口、取样口、放料口，视窗。表面抛光：0.4um温控夹套反应器的控制系统控制系统主板，电源板，信号放大器补料泵操作和显示面板响应元件：自动控制阀，补料泵，气体混合仪B.Braun灌注培养系统灌注系统螺旋过滤器过滤器安装于搅拌轴上 多种孔径可供选择,配合灌注流工艺的需要 悬浮细胞 ( 10um,20 um ), 聚合细胞 ( 40 um ), 微载体 ( 70 um )

9、 可从实验室到生产规模线性放大 316L材质,可在位灭菌 专利技术 可选择过滤器孔径重要提示灌注系统螺旋过滤器孔径的选择：孔径过大，大量的细胞会被抽出；孔径过小，截留下来死细胞过多，留下代谢废物太多。最好选择：根据显微技术分析细胞大小，选择合适的孔径，保证死细胞大部分被抽出，而高活力细胞保留在罐内。目的：保证罐内一直都是高活力的细胞，整个生产周期可以延长很长时间，生产效率和产量将会明显提高。无泡通气装置 通气采用无气泡发生装置,保证细胞正常的氧气消耗的同时,使细胞不会受到剪切力的伤害 通气环管采用高通量,高强度的硅胶管 (专利 DE2940446) 低剪切力搅拌浆大搅拌桨页保证培养基混合均匀的

10、同时,将剪切力降至最低溶氧控制级联控制：数字化集成控制相关参数 控制器AirAirFlow ControllerO2Gas Mix StationN2Gas Mix StationStirStir Speed ControllerPO2控制单元工作原理设定值DOPI控制关联计算空气阀O2阀N2阀被控对象DO检测pH控制系统级联控制：数字化集成控制相关参数 控制器CO2 Gas Mix Station Na2HCO3 Alkali PumpPH控制单元工作原理设定值pHPI控制关联计算碱泵CO2阀被控对象pH检测无菌取样接种无菌传输无菌传输线：硅胶管材质，插针连接（玻璃罐体）；在位灭菌，硬管连接（不锈钢罐体）通过空气压力输送到下一级生物反应器中细胞培养的重要指标细胞密度（贴壁培养主要与微载体能提供的表面积有关），活细胞密度，总细胞密度，生长动力曲线产品表达量，表达产物周期（分泌型细胞，长期保持细胞罐内的细胞为高活力细胞，可以延长生产周期，连续培养）大规模细胞培养反应器技术实验室型细胞培养系统2L、5L、10L中试/生产型细胞培养系统10L、15L、20L、30L大规模细胞培养系统50L、100L、300L 15,000细胞培养的操作过程准备工作：配备培养基、营养成份、Na2HCO3、气体（Air、N2、O2、CO2）、细