本科生物化学与分子生物学实验改革研究

1、本科生物化学与分子生物学实验改革研究摘要：生命科学作为一门以实验为基础的自然科学，本科实验教学也必然是高校培养生物科技人才的重要教学内容之 一。生物化学与分子生物学是生命科学的基础，是自然科学中发展最迅速和最具活力的前沿领域，因此生物化学与分子生 物学实验教学也是生物科技人才培养的重要组成部分。随着生物化学与分子生物学研究技术的不断发展，对相关本科实验 教学也提出了更高要求。同时，现代社会“以人为本”的理念也深入人心，因此在教学中注重学生专业能力提升的同时， 对环境的保护和师生的人身安全也更加关注。基于这两方面的要求，实验室近年来在生物化学与分子生物学实验教学内容 和实验方法的持续改进方面也进

2、行了一些探索，以适应社会发展和生命科学技术发展的需要。关 键 词：本科生物化学与分子生物学实验；实验教学内容；实验方法；实验教学管理；实验室开放Research on the Undergraduate Biochemistry and MolecularBiology Experiment ReformAbstract: Given a natural science based on experiment of life science, undergraduate experiment teaching presents an important course for the culti

3、vation of biotechnology talents in universities. As the basis of life science, biochemistry and molecular biology are the most rapidly developed and the most active frontier fields in natural sciences. Therefore, experimental teaching in biochemistry and molecular biology is also an important part o

4、f the cultivation of biotechnology talents. Along with the development of research techniques in biochemistry and molecular biology are higher requirements raised for the undergraduate experimental teaching. At the same time, as the “people-oriented concept is deeply rooted among the people, the tea

5、ching process should pay more attention to the environmental protection and personal safety of teachers and students while emphasizes the improvement of students professional ability. Based on the two requirements, some explorations in continuous improvement of the teaching contents and experimental

6、 methods in biochemistry and molecular biology have been carried out in recent years, aiming to meet the needs of social development and life science technology development.Key words: undergraduate biochemistry and molecular biology experiment; experimental teaching content; experimental method; exp

7、erimental teaching management; opening laboratory生命科学被公认为21世纪的带头学科之一。 生命科学的发展离不开生物化学及分子生物学, 它们既是生命科学的基础，又是生命科学的前沿1o 生物化学与分子生物学在分子水平探讨生命的本 质，是目前自然科学中发展最迅速、最具活力的 前沿领域。目前在生物学科的本科教学中，生物 化学与分子生物学除了在生物学相关专业中作为 专业基础课开设外，在高校药学和食品科学及一 些化工相关专业的课程设置中也是要求必须设置 的选修课。同时，生命科学作为一门以实验为基 础的自然科学，实验教学也是生物学教学的主要 内容之一，贯穿了

8、整个大学生命科学的教育过 程2-3,生物化学与分子生物学实验更是其中不可 或缺的一环。随着现代社会的快速发展，现代生命科学研 究的发展也是日新月异，各种技术手段层出不穷， 生命科学和生物技术领域中的一系列重大突破， 推动生物产业进入了一个加速发展的新时期4， 对生物学相关的各专业人才的需求和要求大大提 高，同时对本科生物实验课程教学也提出了更高 的要求。为了在有限的课时范围内让学生能够掌 握更多的实验技术，对相关基础理论有更为深入 的理解，也为了进一步提高学生的创新能力和科 学素养，近年来昆明理工大学生物化学本科实验 室持续对生物化学与分子生物学实验课程的内容 和方法进行了不断的改进，以适应现

9、代社会对生 物学研究和生物相关产业发展的人才需求。1实验内容的持续更新随着生命科学的迅猛发展，生物化学与分子 生物学相关技术得到了极大发展，新概念、新知 识层出不穷，其涉及的知识面更广，课程内容更 多。相应地，生物化学实验教学中原有的一些实 验项目已不再适用，被一些更为简洁或准确的实 验方法所取代，同时也增加了一些分子生物学相 关的实验。随着本科实验室硬件设备条件的极大 改善和师资力量的提升，日常科研工作中的新技 术、新成果不断被用于实验教学，教学内容得以 不断更新，实验方法也在不断改革，实验教学已 经从早期的简单现象验证实验发展到以综合设计 性大实验为主，验证性实验为辅，这也有助于培 养学生

10、的创新能力和探索精神。以昆明理工大学生物工程专业生物化学实验 课程为例，从2011年来生物化学实验教学课程组 先后编写了多个版本的实验指导书，对实验教学 内容和大纲进行了持续更新。2011年开设了氨基 酸的分离鉴定纸层析法，牛奶中酪蛋白的分 离纯化，总氮量的测定一凯氏定氮法，考马斯 亮蓝染色法测定蛋白质含量，酶的性质研究，米 氏常数的测定，蛋白质分子量测定一SDS-聚丙 烯酰胺凝胶电泳实验。2012年修订为蛋白质的性 质实验：蛋白质的沉淀反应，考马斯亮蓝染色法 测定蛋白质含量，酶的性质研究，米氏常数的测 定，蛋黄脂质的提取及其分离鉴定，肝糖原的提 取、鉴定与定量，取缔了不适于开展学生实验的 总

11、氮量的测定一凯氏定氮法，以及适用范围不 广的实验，如等电点沉淀分离蛋白的牛奶中酪蛋 白的分离纯化实验，氨基酸的分离鉴定一纸层 析法，增加了硫酸铵沉淀蛋白质实验、脂质的薄 层层析实验和糖原的实验，使实验内容更全面。 由于分子生物学技术的快速发展，在2014年加入 了分子生物学的内容一质粒提取及验证实验。为了配合我国从工程教育大国走向工程教育 强国，强化培养学生的工程能力和创新能力的目 标5，我们以专业综合实验为抓手，大力探索学生 工程实践能力与创新精神培养为导向6，2016年 对生物化学和分子生物学实验课程进行了综合实 验课程体系及内容的优化与重构，开设了综合性 大实验，包含了以下内容：重组唾液

12、淀粉酶表达 质粒的提取及鉴定，唾液淀粉酶的表达、提取及 纯化，重组唾液淀粉酶的酶学性质研究，SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳。因为课时有限，取缔了蛋黄 脂质的提取及其分离鉴定实验和肝糖原的提取、 鉴定与定量实验，仅提供视频进行观摩学习，考 马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量实验则作为考试 项目。随着分子生物学的快速发展，以其为基础的 基因工程则以现代分子生物学的先进方法为技术 手段，以体外构建的重组DNA分子导入受体细胞 改变原有生物的性状的模式，一跃成为当今自然 科学领域理论创新最活跃、进展最迅速、发展最 具活力的前沿科学7o仅仅一个简单的质粒提取及 鉴定分子生物学实验显然难以满足培养生物科技 人才的需

13、求，因此2018年我们在理论和实验课程 上做出了较大改革，分子生物学相关内容作为单 独的基因工程课程开设出来，其实验包含了大肠 杆菌基因组DNA提取与检测，基于16S rRNA基 因的PCR扩增、电泳和胶回收，基因克隆连 接、转化，质粒的提取与阳性克隆检测内容，而 生物化学则保留原有的3个蛋白质相关的实验： 唾液淀粉酶的表达、提取及纯化，重组唾液淀粉 酶的酶学性质研究，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在此基础上恢复了蛋黄脂质的提取及其分离鉴定 实验，增设了植物DNA的小量法提取及鉴定。在实验方法上，层析方法从原有的纸层析技 术发展到薄层层析，后续又扩展为薄层层析和柱 层析并存，分离原理有别，适用对

14、象不同，涉及 多个分离纯化手段，如亲和层析、分子筛凝胶过 滤和聚丙烯酰胺凝胶电泳等，有利于学生对不同 实验技术手段的理解学习和发散思维的形成。此 外，柱层析还结合仪器在线检测对结果进行分 析，在技术手段上明显提升，对学生的动手能力 以及从实验成果获得的成就感具有良好的提升作 用。在内容上，增加了比较全面的分子生物学内 容，如细菌和植物DNA的提取，16S rRNA基因 的PCR扩增、电泳和胶回收，原核表达载体的构 建及鉴定。结合生物化学中蛋白诱导表达及分离 纯化，优化和重构了生物化学和分子生物学实验 课程体系。在不断探索的过程中，听取专家的建 议，结合学院开设的其他专业课程实验，还原了 以前曾

15、删减的蛋黄脂质分离纯化鉴定及蛋白质含 量测定等实验内容，改革过程中删减的部分内容 还采用教学录像的形式放在网上供学生观摩学 习，保证和扩大了实验内容的覆盖范围。生物化学实验课程最初的实验内容对各实验 项目之间的有机结合和相互连贯性重视程度不 够，验证性实验居多，综合性、研究性实验较 少，内容也跟不上学科的发展需求，这种墨守成 规的教学模式很难调动学生的实验积极性，实验 教学的效果难以体现。随着实验内容的不断更新 和分子生物学相关实验的开设，实验教学也逐渐 形成体系：从载体构建、质粒提取鉴定到蛋白诱 导表达和分离纯化、性质及鉴定形成了综合设计 性大实验，同时不能纳入综合性实验的部分仍作 为验证性

16、实验开设，丰富了实验内容。学生对课 程内容体系能更全面地理解和学习，也有利于学 生创新能力的培养及学生综合素质的提高。另 外，本科实验室还申请了学校的学生能力提升项 目供学生选择，以达到学生综合运用生物化学与 分子生物学手段解决实际问题的能力。当然，在生物化学与分子生物学实验教学中 值得提高和改进的地方还很多。如现在生物大分 子的性质和遗传信息方面的实验内容已经比较全 面，但是生命是一个动态的过程，代谢是动态的 直观表现，目前动态过程的实验涉及得很少，可 以设计相关实验来进行实验教学，以增加学生对 代谢过程的理解，有助于提高学生发现问题和解 决问题的能力。2实验方法的不断改进随着“以人为本”的

17、理念深入人心，人们不 断地寻求自然、人与社会之间的总体性和谐发 展，人们对生命价值的正视度和对环境的保护意 识不断提高，实验室安全和环保工作也面临着巨 大的压力和挑战凶。在近几年的实验教学中，实验 室改进了多个实验方法，减少有毒试剂的使用， 以减少环境污染和保护人身安全。同时也通过缩 短实验时间，在有限的课时内可以开展更多的实 验项目，以满足师生多方面的需求。2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳作为一个广泛应用的重 要实验方法，在多个专业的生物化学及一些分子 生物学实验中都有开设。该方法从配胶、制胶到 电泳、染色、脱色，费时很长，尤其是常规的考 马斯亮蓝R250染色方法在染色后需要进行长

18、时间 脱色，中间还需要多次更换脱色液。此外还需要 用到大量甲醇和冰乙酸，在实验教学上不方便使 用。有很多研究对蛋白胶染色方法进行了探 索9-11，实验室通过比较，选择了一个最为简便快 速的方法1气 该方法采用考马斯亮蓝G250来进行 染色，在染色和脱色过程中主要采用去离子水作 为溶剂，仅在染色液中加入30 mM HCl以调节 pH值，通过加热的方式来加速染色和脱色的过 程。随后对该方法进行了验证并将步骤进行了细 化，和常规的考马斯亮蓝R250染色方法的效果进 行了比较13。该方法40 min左右即可完成染色脱 色，可以当堂完成，效果甚至优于常规的考马斯 亮蓝R250染色方法，结果如图1所示。随

19、后将该 方法应用于教学，不仅极大地节约了时间，还减 少了有机试剂的使用，降低了成本，对环境保护 和人身安全也起到保护作用，该方法在不需要回 收蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳中有实际应用价 值。国产的一些试剂公司，如碧云天，也有类似 的或者效果更好的快速染色试剂生产，可根据需 求选择使用。10 gg 5 曲 2 曲 1 曲 0.5 曲 0.2 gg 0.1 曲 0.05 曲(a)考马斯亮蓝R250染色脱色后的凝胶成像图10 gg 5 gg 2 gg 1 gg 0.5 gg 0.2 gg 0.1 gg 0.05 gg(b)考马斯亮蓝G250快速染色的凝胶成像图图1两种不同方法中牛血清白蛋白 (BSA)S

20、DS的染色图92.2蛋黄脂质的提取与鉴定在生物化学和分子生物学实验中或多或少会 接触到一些挥发性的有毒有机试剂。除了上述聚 丙烯酰胺凝胶电泳实验，在以前蛋黄脂质的提取 及分离鉴定实验中提取总脂质使用的氯仿和甲醇 都具有挥发性和毒性。在普通的生物学本科实验 室里一般都配备了几个通风橱，以便一些有毒和 挥发性试剂的操作，但在学生实验操作台上无相 关设施。并且提取蛋黄操作的时间比较长，会对 人体产生较大危害。相关研究显示，在蛋黄脂质 提取过程中，随着提取方法的不同，被提取出来 的蛋黄脂质的数量和组成会有很大差异，其相应 的性质、功能和应用也各不相同14o乙醇是一种 很好的溶剂，能溶解油脂，浓度高的乙

21、醇还可以 沉淀蛋白等大分子物质及一些水溶性的物质，从 而将脂类从蛋黄中提取出来。虽然乙醇对甘油三 酯的溶解性不好，但是在加热的条件下能克服这 一缺点。以鸡蛋黄为原料，在5065C温度区间， 乙醇对卵黄油有很好的萃取效果15，用95%的乙 醇加热的方法来提取蛋黄中的总脂质，提取率达 到 95.04% 以上14o实验教学中将蛋黄脂质的提取方法改为95% 乙醇，65 水浴30 min萃取两次，随后进行薄层 层析，得到了和氯仿-甲醇方法提取相似的结果， 如图2所示。提取溶剂三酰甘油胆固醇脑磷脂卵磷脂氯仿三酰甘油胆固醇脑磷脂卵磷脂氯仿-甲醇95%乙醇图2不同提取方法提取蛋黄脂质的薄层层析图谱 该方法虽然

22、提取时间略长，但不需要两相萃 取步骤，可以在相同甚至更短的课时条件下完 成。虽然减少了二相系统的萃取过程，但增加了 学生对乙醇提取生物大分子的相关性质的理解。 另外，在DNA提取实验的过程中涉及二相系统萃 取的知识，起到了补充作用，因此该方法完全能 满足实验教学的要求，同时避免了有毒挥发性有 机溶剂氯仿和甲醇的使用。2.3质粒提取及检测随着生物科学的发展，各种实验方法和技术 都得到长足发展。采用DNA快速连接试剂盒、质 粒提取试剂盒和胶回收试剂盒等方式，很大程度 上降低了实验准备所需的时间和劳力，缩短了实 验时间，使得实验的重复性更好，还极大提高了 实验的成功率。另外，还有一些高性能试剂的开

23、发也达到了相同的效果，如Kapa公司开发的可用 于普通PCR反应的Kapa2G快速PCR kit，延伸速 度高达1 kb / s，具有高灵敏度和高特异性。实验室最初拟采用该高效快速的试剂来进行 本科实验，随后借鉴以上快速酶的特点，在检测 质粒的PCR中采用了扩增特异性103 bp小片段的 方法，使用康为试剂的2xTaq Plus Master Mix，其 扩增效率为2 kb/min。在实际的使用过程中，预变 性时间为8 min，将变性时间调整为10 s，退火时 间为5 s，延伸时间1 s，对单菌落进行30个循环 的扩增，约50 min可以得到清晰明亮的条带，也 达到了更短时间完成扩增的目的，再

24、结合质粒提 取试剂盒的使用，质粒提取和鉴定的实验在4个 学时内即可完成，结果如图3所示。然而在扩增 140 bp片段的时候，需要5 s以上的延伸时间才能 扩增到目的片段，结果如图4所示。这可能是因 为PCR仪升温和降温需要一定时间，扩增的温度 也有一定范围，因此103 bp的片段延伸时间（理论 延伸时间为3 s）为1 s可以完成扩增，大一些的片 段则不能得到相应结果。因此在实际运用的过程 中，还应根据使用的仪器、模板、引物结构和目 的片段大小不同进行相应的改进和优化，进行预 实验获得适宜的条件。在实验教学中，可以根据实际用途采用不 同的DNA合成酶扩增全长或不同片段来达到实 验目的，在扩增全长

25、目的基因的时候可以考虑 采用高保真的快速扩增DNA合成酶，达到极大 缩短扩增时间、提高成功率的目的。通过试验， 缩短实验时间，在相同的教学时间内，可以开 设更多实验项目。如前两年已经删除的蛋黄脂 质实验，在专家的建议下，考虑到实验内容的 覆盖面，课程组对实验学时进行了调整又重新 开设，该实验在方法上也有进一步改进。此 外，作为本科实验指导教师，平时应多关注相 关专业方向的技术研究进展和试剂开发情况， 以便更好地提高教学质量，培养学生与时俱进 的精神和科研创新能力。a Mb c2 000 bp .a Mb c2 000 bp .1 000 bp -750 bp -500 bp -250 bp 一

26、100 bpMMarker, a一普通酶按常规程序扩增， b一普通酶按快速酶程序扩增，c一快速酶扩增- 图3质粒检测中不同DNA合成酶扩增图103 bp140 bp2 000 103 bp140 bp2 000 bp -1 000 bp -750 bp -500 bp 一250 bp100 bp 一10s 5s 2s 1s M 1s 2s 5s 10s图4 2xTaq Plus Master Mix采用不同延伸时间扩增不同 大小的DNA片段的结果3实验教学管理的改进和实验室开放力度 的加大除了在实验内容和实验方法上的改进外，在 实验教学管理上也对教师和学生提出了更高的要 求问。对教师在实验准备、实验教学方法与实验 成绩的评定方面要求更加严格，对学生的预习、 实验操作规范及实验报告的撰写等方面也提出了 更详细的要求。在实验课程结束后还增加了实验 理论考试和实验操作考试部分，也取得了较好的 效果。学生整体素质有显著提高，在进入后续的