酸性稻田土n-damo细菌的多样性和丰度

1、酸性稻田土 n - damo细菌的多样性和丰度摘要：亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(n-damo)细菌是新近发现的一类具有特殊功能的微生物，在废水深度脱 氮领域具有潜在应用前景。研究利用n-damo菌16S rRNA和pmoA基因的专一性引物，通过系统发育分析和定量PCR 技术，检测酸性稻田土中该类群的多样性和丰度。结果显示，在弱酸性中等养分水平的稻田土中，n-damo菌聚为3 4 个OTU?类群；系统发育分析表明，酸性稻田土中存在新型未知n-damo类群；n-damo细菌丰度较高，16S rRNA基因 拷贝数可达1.25 - 2.31 X108拷贝每克干重，pm-A基因拷贝数为8. 66 x 1

2、06 2.54 X107拷贝每克干重。研究为后 续富集培养嗜酸型n-damo菌提供可靠菌源。关键词：亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化细菌；酸性稻田土；系统发育分析；定量PCR0引言亚硝酸盐依赖型甲烷厌氧氧化(nitrite -dependent anaerobic methane oxidation， n - damo) 是 由一类特殊功能菌介导完成、在厌氧条件下耦合 甲烷氧化与亚硝酸盐还原的酶促反应过程12! Ettwig等通过厌氧富集培养和宏基因组学技术手 段，在河流底泥中检测到n-damo功能菌的存在， 并命名为 Candidatus Methylomirabilis oxyfera ( M.

3、 oxyfera 3-5。该类菌在厌氧条件下，通过新型 胞内自产氧途径氧化甲烷，并获取生长代谢的能 量。甲烷单加氧酶是甲烷氧化代谢途径的关键 酶，编码甲烷单加氧酶a亚基的pmoA基因可作 为鉴定n-damo细菌的遗传分子标记。在污水厌氧生物处理领域，存在厌氧段温室 气体甲烷无序排放、出水总氮不达标等问题，限 制了厌氧技术在水处理领域的大规模推广应用。 N-damo过程可利用原位产生的甲烷进行脱氮, 无需外源添加其他碳源，同时实现温室气体的减 排和出水总氮的达标，是兼具环境友好型和经济 节约型的新型脱氮工艺，具有潜在应用 前景近年来，越来越多研究证实n-damo功能菌 在自然界中分布广泛，河流底

4、泥、湿地、河口沉 积物、淹水稻田土、剩余污泥等生态系统中均不 同程度检测到n-damo细菌的存在项-,但鲜有 研究报道酸性环境中该类菌的赋存情况。此外， n-damo细菌生长代谢速率低、代时长，富集培 养耗时久，限制了 n-damo在实际污水处理中的 推广应用区。因此，从其他生境中寻找更多n- damo菌源进行富集培养驯化是未来该领域发展的 重要方向之一，也是突破应用瓶颈的关键所在。基于此，本研究重点关注酸性厌氧生境典型 代表一发育自酸性红壤的淹水稻田土，借助微 生物分子生态学检测手段，解析其中n-damo细 菌的多样性和丰度，以期为后续的富集培养研究 提供菌源。1材料与方法1.1 土样的采集

5、及理化性质的测定本研究选取四川眉山（经纬度：E 10314 20； %45。5,58.87）稻田土作为研究对象，采 用五点随机采样法采集三块不同点位的稻田土壤 样品（分别命名为MS-I, MS-II和MS-III）采 样时间为2019年6月，正值水稻种植晚期，稻 田为淹水状态，自水土交界面向下延伸20 cm采 集表层土样。采集的土样经充分混匀后，无菌条 件下，取0. 5 g置于2 mL bead - beating离心管 中，低温运输至实验室，-800保存，用于后续 分子生物学检测。剩余土样风干后，剔除植物残 体、石砾，研磨过筛，常温保存，用于土壤理化 性质的测定。土壤有机质和全氮含量采用国家

6、标 准检测方法（GB9848 -44 和 HJ-717-2014）进 行测定，土壤分别用去离子水和1 mol/L KC1浸 提后，采用酸度计（雷磁，PHS - 25）测定 pH值。1.2 土样核酸DNA的提取采用土壤核酸提取试剂盒（MP FastDNA! Spin Kit for Soil），参照试剂盒方法说明书，提取 土壤样品的核酸DNA。采用1%琼脂糖凝胶电 泳，检测土样DNA的提取情况，采用超微量分 光光度计（Biofuture，MD2000D）测定核酸浓度 和纯度。1. 3 基于n -damo细菌16S rRNA基因和pmoA 基因的聚合酶链式反应和克隆测序以1.2提取的DNA为模板，

7、采用巢式聚合 酶链式反应 （nested - polymerase chain reaction， nested -PCR）扩增样品中n - damo细菌的16S rRNA基因和pmoA基因，PCR扩增引物参见表 1；采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生 化）纯化目标基因的扩增产物；利用DNA T4连 接酶将纯化后的目标基因连接至PMD19-T质粒; 将重组质粒转化至大肠杆菌JM109的感受态细胞 中，利用蓝白斑筛选，得到含有目标基因的阳性 克隆子；分别随机挑选30个含有n-damo细菌 16S rRNA基因和pmoA基因的阳性克隆子，送样 至上海生工测序平台进行一代Sanger法测序。表1

8、本研究所涉及的引物具体信息Table 1 Detail Information of Primers in the Study引物名称引物序列靶基因用途参考文献202FGACCAAAGGGGn-damo - specificn-damo 16S rRNA基因巢式PCR第一段4GCGAGCG16S rRNA扩增的正向引物1545RCAKAAAGGAGGGeneral bacterialn-damo 16S rRNA基因巢式PCR第一段4TGATCC16S rRNA扩增的反向引物qPlFGGGCTTGACATCCCACGAACCTGn- damo- specific16S rRNAn-damo 1

9、6S rRNA基因巢式PCR第二段 扩增的正向引物；n-damo 16S rRNA基 因定量PCR正向引物4 续表引物名称引物序列靶基因用途参考文献qP2RCTCAGCGACTTCn-damo - specificn-damo 16S rRNA基因巢式PCR第二段4GAGTACAG16S rRNA扩增的反向引物qP1RCGCCTTCCTCCn- damo- specificn-damo 16S rRNA 基因定量 PCR 反4AGCTTGACGC16S rRNA向引物A189_ bGGNGACTGGGACTTYTGGGeneral bacterial pmoAn-damo pmoA基因巢式PC

10、R第一段扩增 的正向引物 6 cmo682AAAYCCGGCRAAGAACGAn- damo- specific pmoAn-damo pmoA基因巢式PCR第一段扩增 的反向引物 6 cmo182TCACGTTGACGCCGATCCn- damo- specific pmoAn-damo pmoA基因巢式PCR第二段扩增 和定量PCR的正向引物 6 cmo568GCACATACCCATCCCCATCn- damo- specific pmoAn-damo pmoA基因巢式PCR第二段扩增 和定量PCR的反向引物 6 1.4系统发育树的构建将测序结果上传至NCBI BLAST （ https:

11、 / blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）,获取相应参比序 列，利用 MEGA 5. 0 软件，经 Neighbor-joining 计算 方法比对建树后，明确待测菌株的遗传学分类。1. 5 基于n -damo细菌16S rRNA基因和pmoA 基因的定量PCR以1.2提取的DNA为模板，采用定量PCR 技术（quantitative polymerase chain reaction， qPCR）检测样品中n-damo细菌的丰度，qPCR 检测试剂为 Power SYBR Green PCR Master Mix （Promega），检测仪器为实时荧光

12、定量PCR仪 （ABI 7500），qPCR 引物详见表 1。2结果与讨论2.1眉山稻田土理化性质分析本研究共采集3份土样，去离子水浸提pH 值均小于6.0，1 mol/L KCl浸提pH值均小于 5.5,有机质和总氮含量分别在20 30 g/kg和 1.02.0 g/kg范围内波动（表2） 0根据2015年 洪雅县土肥站的土壤养分调研报告切，本研究 所涉及土样均属于微酸性中等养分水平土壤。已 知n-damo细菌在中性环境分布广泛项-15，但鲜 有研究报道酸性环境中该类群的多样性及丰度, 故解析酸性土样中n-damo菌的赋存情况，对开 辟新的菌源意义重大。此外，寻找特殊生境条件 下的n-dam

13、o细菌，有助于富集培养具有独特生 理代谢功能的微生物，例如嗜酸性的n-damo细 菌，用于低pH污水的深度脱氮处理。表2 土样的基本理化性质Table 2 Basic Physio-chemical Properties of Soil Samples土样编号pH （去离子水浸提， 无量纲）pH （ 1 mol/L KCl 浸提， 无量纲）有机质（g/kg）总氮（g/kg）MS-I5. 47 土 0. 324. 66 土 0. 3421. 12 土 1.001.16土 0. 05MS-II5. 74 土 0. 155. 28 土 0. 2622.01 土 1.281.32土 0. 12MS-I

14、II5. 66 土 0. 085. 25 土 0. 1821. 97 土 2. 061.25土 0. 042. 2 N-damo细菌的定性检测和389 bp （ pm-!基因）“反。本研究成功扩增得根据文献可知，巢式PCR第二段扩增反应的到n-damo细菌特异性的16S rRNA基因和pmoA目标基因长度分别为460 bp （ 16S rRNA基因） 基因，如图1所示，泳道1、3和5为核酸DNA0.020.02Marker （ 100 bp ladder,自下而上依次为 100 bp 600 bp） , 2和4分别对应n-damo细菌特异性 pmoA基因和16S rRNA基因片段，扩增条带清

15、晰、亮度高、无非特异性扩增条带、扩增长度与 文献报道相吻合，可进行后续克隆测序分析。图# n-damo细菌#6S nRNA和pmoA基因巢式PCR第二段扩增产物电泳图谱Fig. 1 Electrophoretic Image of n-damo-specific16 S rRNA and pmoA Gene Fragment2-3酸性稻田土中n-damo细菌的多样性本研究分别对n - damo细菌特异性的16S rRNA基因和pmoA基因进行系统发育分类鉴定， 以便更客观准确地反映n-damo细菌的多样性赋 存情况。基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因序 列相似度的聚类分析结果得出

16、，样品中的n-damo 细菌分别聚为4和3个OTUs （ Operational taxonomic units,可操作分类单元），如图2和图3中 的红色圆圈所示。系统发育分析表明，本研究检测到的n- damo 细菌位于 Candidatus Methylomirabilis oxyfera 系统发育分支，绝大多数酸性稻田土中的n- damo细菌与其它中性生境中检测到的n-damo细 菌亲缘关系较近。例如，图2的OTU1与太湖底 泥环境样品克隆子TH4-27相似度达98%以 上询，其余OTUs与西溪湿地、红树林湿地沉积 物、黄河河口底泥、中性稻田土壤等环境样品中 的n-damo细菌均具有较高的

17、相似度（图2和图 3）9-11。此外，研究还发现，基于n-damo 16S rRNA和pmoA基因的系统发育分析结果均指示， 酸性稻田土中存在未知OTU （图2的OTU4和图 3的OTU3），与现有数据库中的序列均不匹配， 推测本研究土样中可能含有独特的n-damo细菌。 后续研究工作可增加样本量，采集更多酸性环境 土壤样本，以验证本研究的检测结果。 OTU1I Taihu lake sediment clone TH4-27 (JX235751)I- Xixi wetland clone XXB30-5 (KC905816)L Mangrove sediment clone MSN16S-2

18、 (KX511991)Estuarine and coastal sediments clone 16S-March-S05-34 (KX260605) |j.OTU2sH-Sludge enrichment clone Enr1-11 (KY078438)OTU3ion I Yellow river estuary sediment clone A49 (KP296954) .OTU4Candidatus Methylomirabilis oxyfera (FP565575) Candidatus Methylomirabilis sp. RS3 (KU891932)Desulfonauti

19、cus autotrophicus DSM 4206 (NR 044591)图2 基于n-damo细菌16S rRNA基因的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic Tree Based on n-damo16S rRNA Gene基于n-damo pmoA基因的系统发育树树根为 好氧甲烷氧化菌Methylomonas，从图3可知，本 研究扩增所得pmoA基因序列全部归属于Candidatus Methylomirabilis oxyfera系统发育分支，未见 好氧甲烷氧化菌，证实了 cmol82-cmo586这对引 物的专一性，利用该引物对能够靶向鉴定环境样 品中n-damo厌氧甲烷

20、氧化菌的赋存情况囱。83 1eoTui Candidatus Methylomirabilis oxyfera (FP565575) |iSludge enrichment clone 1-4 (KY078446)1Enrichment clone RS1 (KT443986)*0.05 *Paddy field soil clone JYPS6-13 (KF546914) .OTU3 Methylomonas sp. LC 1 (DQ119046)图3 基于n-damo细菌pmoA基因的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic Tree Based onn- damo pmoA Ge

21、ne2- 4酸性稻田土中n-damo细菌的丰度本研究采用针对n-damo细菌16S rRNA基因 和pmoA基因的定量PCR，检测酸性稻田土中n- damo细菌的丰度。研究共检测了三块样田，MS- I、MS-II 和 MS-III 样田中 n-damo 16S rRNA 基 因拷贝浓度分别可达1-25 x 108、2.31 x 108和 1- 34 x 108拷贝每克干重，pmoA基因拷贝浓度 分别为 8- 66 x 106、2- 54 x 107和 1.55 x 107 拷贝每克干重。其中，pmoA基因普遍比16S rRNA基因丰度低一个数量级，可能的原因在于n -damo细菌单个细胞中含有多个16S rRNA基因拷 贝，但通常pmoA基因为单拷贝。对比其他研究 发现，不同生境中的n-damo细菌16S rRNA基因 丰度值波动较大，其中，三峡江水水位波动带最低，仅为4.70 X1Ocopies /g,长江河口