基因工程制药-4 纯化.质控课件

1、 基因工程制药（4.纯化.质控） 获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌(或细胞) 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤： 半成品检定 成品检定包装 基因工程药物生产的一般程序细菌过滤器：蔡氏滤器EKS、 G5、 G6玻璃滤器3.8基因工程药物的分离纯化一.特点和分离纯化的基本过程 1.特点：初始物料组成复杂目的产物含量较低 稳定性差 质量、纯度要求较高产品(目的产物)质量的要求产品用途决定纯度要求：体外诊断试剂允许一定量的杂质存在，要求纯度在80%以上；体内治疗用产品应具高纯度98%以上。产品活性: 产品剂型，贮存要求和稳定性。2.分离纯化的基本过程 精细纯化粗级分离 胞内表达胞外表达二.

2、分离纯化技术 (1) 细胞收集：离心分离，膜过滤 1.细胞破碎与固液分离（前处理）CENTRITECH LAB细胞浓缩及回收系统CENTRITECH CELL细胞浓缩及回收系统轻柔式离心，保持 高细胞活性 自动连续分离细胞 用于生物制药工业高速组织捣碎机超声波细胞破碎仪超声波破碎法(中、小量) 非接触式全自动超声波破碎仪非机械破碎法:酶溶法: 利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌作用效果好。化学渗透法： 利用有机溶剂(苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂(SDS、Triton)、金属螯合剂(EDTA)、变性剂(脲、盐酸胍)等可以改变细胞壁

3、或细胞膜的通透性,从而使内含目的物有选择地渗透出来。 选择破碎法一般原则:若提取的产物在细胞质内,需用机械破碎法；若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法;若提取的产物与细胞膜或壁相结合时,可采用机械法和化学法相结合的方法。 超滤膜仅截留相对分子质量较大(约103_ 106) 的有机物质 一般的反渗透膜可以截留几乎所有的盐和有机物 超滤纯化双水相萃取系统是由两种水溶性高聚物或一种高聚物与无机盐在水溶液中混合而成,由于两相均含较多的水,称为双水相。 常用的双水相系统有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖、聚乙二醇(PEG)/无机盐。2.目的产物（重组蛋白质）的分离纯化美国GE公司蛋白质分离纯化装置 上海厦美公

4、司蛋白分离层析系统分部收集器记录仪蠕动泵梯度混合仪生产用的层析柱蛋白质产物的性质 方 法 电荷（等电点） 离子交换（IEX） 分子量 凝胶过滤（GF） 疏水性 疏水（HIC）反相 （RPC）特异性结合 亲和（AC） 蛋白质分离方法的选择 Reversible specific bindingSample application and washEquilibration Elution亲和层析选择性最强；不放在第一步； 否则： 杂质多，寿命短； 体积大，介质贵一步纯Production and purification of fusion proteinsSchematic overview

5、of GST fusion protein purification using GSTrap. (2)离子交换色谱 (ion exchange chromatography,IEC)Charged amino acids on the surface of a protein can bind to oppositely charged ligands of the ion exchanger. Arrows indicate some charged regions of lysozymeThe higher the net charge, the higher the salt conc

6、entration required for desorption. 1 2 3 4 5 6阴离子交换树脂6.Regeneration 2.Sample application and wash1.Equilibration3.4.5Gradient elution分离纯化采用的方式: 正吸附: 将目的产物离子化,然后被交换到介质 上,杂质不被吸附而从柱中流出。 优点：产物纯度高,浓缩作用,适于处理目的产 物浓度低、工作液量大的溶液; 负吸附: 将杂质离子化后交换,目的产物不被交 换而直接流出。 适用于处理目的产物浓度高的工作液,通常只 可除去50%-70%的杂质,产物的纯度不高。 蛋白质是两

7、性分子； 若在低pH范围稳定，带正电，用阳离子交换剂； 若在高pH范围稳定，带负电，用阴离子交换剂；等电点处于极端位置：pI8的基因工程产物首选离子交换色谱；盐析样品不宜直接上离子交换，可直接疏水色谱； 洗脱时，采用pH梯度或离子强度梯度（常用） 连续梯度 步级梯度离子交换剂可以通过再生反复使用。 分辨率高、容量大、操作容易！强/弱阴离子交换树脂强/弱阳离子交换树脂(3)凝胶过滤（gel filtration） 凝胶过滤色谱脱盐，换缓冲液；分级分离（杂蛋白分子量一般大于30KD）(细胞因子分子量一般约15KD)(300-500bp；100多个氨基酸)；产品成形前去除多聚体或降解产物，避免不均一

8、性；规模小，速度慢，一般放最后。(4)疏水色谱 Hydrophobic interaction chromatography (HIC) 疏水色谱介质疏水基团：苯基、辛基；蛋白质疏水区域：苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸 侧链；高盐吸附, 低盐洗脱；盐析样品不宜用离子交换，可直接疏水色谱Gradient elutionEquilibrationSample application and wash Regeneration层析的一般过程： 平衡； 上样，淋洗； 洗脱，收集； 再生3.非蛋白质类杂质的去除非蛋白质类杂质主要有DNA、热原和病毒 (1)DNA的去除：pH4，DNA呈阴离子,目的蛋

9、白质pI6，可用阴离子交换剂吸附除去。蛋白质为强酸性,选择条件使其吸附在阳离子交换剂上,不让DNA吸附上去。利用亲和层析吸附蛋白质,而DNA不被吸附。疏水层析高盐浓度上柱,使DNA蛋白质结合物离解,蛋白质被吸附在柱上,而DNA不被吸附。(2)热原的去除 热原质：肠杆菌科所产生的细菌内毒素,在细菌 生长或细胞裂解时释放出来,是 G- 细胞壁组分-脂多糖,相当稳定,经高压灭菌不失活。防止热原产生：分离纯化在无菌条件下操作。层析介质，洗脱液需先经无菌处理,流出的蛋白质溶液应无菌处理（0.2m滤膜）热原（脂多糖）是阴离子物质,用阴离子交换层析法去除。此时应调节pH使蛋白质不被吸附。注射用药必须无热原！

10、(3)病毒的去除 病毒最大的来源是由宿主细胞带入。经过色谱分离,一般能将病毒除去,也可以用紫外线（UV）照射使病毒失活,或用过滤法（NF）将病毒去除。 三.选择分离纯化方法的依据1.根据产物表达形式来选择分泌型表达产物： 发酵液体积大、浓度低,先浓缩（沉淀、超滤/最常用）。周质表达产物： E.coli经低浓度溶菌酶处理,再用 渗透压休克法，杂蛋白少，易纯化。细胞内可溶性表达产物（融合蛋白）： 破菌后的可溶性离心上清液,首选亲和层析分离方法（pBG-2 融合表达），或选用离子交换色谱包涵体内表达产物： 包涵体对蛋白质分离纯化的影响: 1.很容易与胞内可溶性蛋白杂质分离,重组蛋白纯化较容易完成;

11、2.包涵体中重组蛋白质产物经过了一个变性复性过程,较易形成蛋白产物的错误折叠和聚合体。包涵体的分离和重组蛋白质的纯化步骤: 细菌收集与破碎 包涵体的分离 洗涤与溶解 变性蛋白质的纯化 重组蛋白质的复性 天然蛋白质的分离 2.根据分离单元之间的衔接选择先运用非特异、低分辨的操作单元(如沉淀、超滤和吸附等),缩小样品体积,提高产物浓度,去除最主要的杂质(包括非蛋白类杂质);再采用高分辨率的操作单元(如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱);最后用凝胶色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元,这样可以提高分离效果，也可以换成产品的缓冲液。3根据分离纯化工艺的要求选择(1)具有良好的稳定性和重复性(2

12、)尽可能减少组成工艺的步骤尽可 能少(4-5个)(3)组成工艺的各操作单元要相互适 应和协调,工艺与设备也能相互适 应,从而减少步骤间对物料的处理 和条件调整 (4)在工艺过程中要少用试剂,以免增加分 离纯化步骤,或干扰产品质量 (5)分离纯化工艺周期尽可能短（流程要 快） (6)工艺和技术必须高效,收率高,易操作, 对设备条件要求低,能耗低 (7)具有较高的安全性：无菌、无热原、 无污染。 3.8 基因工程药物的质控 一、原材料的质量控制确保编码药品的DNA序列正确性,重组微生物来自单克隆,所用质粒纯而稳定,保证产品质量的安全性和一致性明确一系列特性:目的基因的来源、克隆经过,表达载体的名称

13、、结构、遗传特性及其各组成部分的来源与功能,构建中所用位点的酶切图谱,抗生素抗性标志物;应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性等二、培养过程的质量控制在工程菌菌种贮存中,要求种子克隆纯而稳定;在培养过程中,要求工程菌所含的质粒稳定,始终无突变;在重复生产发酵中,工程菌表达稳定;始终能排除外源微生物污染。生产基因工程产品应有种子库,并证明种子库不含致癌因子,无污染,并由原始种子库建立生产用工作细胞库。三、纯化工艺过程的质量控制产品要有足够的生理和生物学试验数据,确证提纯物批间保持一致性;外源蛋白质、DNA(100pg/剂量)与热原质控制在规定限度以下。精制过程中能清除宿主细

14、胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质,并有检测方法。 四.目标产品的质量控制 （蛋白质药物的质量控制*）产品的鉴别纯度分析生物活性测定稳定性考察产品一致性的保证IVIG(液体) 检定结果的比较 1.产品的鉴别 重组蛋白质药物产品常用的鉴定方法 电泳方法: SDS,等电点聚焦,免疫电泳 免疫学分析方法: 放免法(RIA),放射性免疫 扩散法(RID),酶联免疫吸附法 (ELISA),免疫印迹 受体结合试验(receptor binding) 高效液相分析法(HPLC) 肽图分析法 Edman N末端序列分析法 圆二色谱(CD) 核磁共振(NMR) (1)肽图分析肽图

15、分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。肽图分析是检测蛋白质一级结构中细微变化的最有效方法。肽段的检定通过AA组成分析及N末端测序(过去)；用高效液相色谱或毛细管电泳(CE)测定（现在）。肽图分析可作为基因工程产品与天然产品或参考品作精密比较的手段。肽图分析结果与AA成分和序列分析结果合并,作为蛋白质的精确鉴别。对含二硫键的制品,肽图分析图可确证制品中二硫键的排列 A.酶切肽图分析方法 (胰蛋白酶裂解)待检样品处理 将浓度为1mg/ml的待检样品及对照品分别对1%碳酸氢胺溶液充分透析，按酶与蛋白质溶液之比为1：50（w/w）加入胰蛋白酶，37保温24小时后，10000r/

16、min离心5分钟，收集上清(或者用0.45um的滤器过滤). 分析方法 用RP-HPLC对离心后上清进行分析。色谱柱为蛋白和多肽分析用的C8或C18柱，上样量为100l，流速为1ml/min。A液为含0.1%三氟乙酸的水溶液，B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。连续梯度洗脱70分钟(A液从100%至30%， B液从0至70%)，检测波长为214nm。 HPLC B.化学裂解肽图分析方法 （溴化氰裂解）待检样品处理 取相当于50g蛋白的待检样品及对照品分别用超纯水透析至少16h，冻干。复溶于20l 裂解液中，室温裂解24小时，然后裂解物加入180l超纯水，再冻干。冻干的裂解物用超纯水复溶至适当浓

17、度。(2)氨基酸(AA)成分分析AA分析仪L8800型日立全自动氨基酸分析仪一般含50个左右Aa残基的蛋白质的定量分析比较准确。而含100个左右的Aa残基的蛋白质的成分分析产生较大的偏差,相对分子质量越大,偏差越严重。原因:不同Aa的肽键在水解条件下,有些水解不完全,有些则被破坏。完整的Aa成分分析结果,应为3次测定的平均值,包括甲硫氨酸、胱氨酸和色氨酸的准确值。(3)部分氨基酸序列分析 491型蛋白质测序仪(4)重组蛋白质分子量的测定 凝胶过滤法 SDS法采用凝胶过滤法测定分子量Sepharose 4B柱(2 cm50 cm)用0.1 mol*L-1 KCl按恒定流速(10 ml*h-1)平

18、衡24 h。将分子量分别为25000, 80000, 270000, 670000的Dextran(右旋糖苷)标准品相继上柱(每管收集4.4 ml),苯酚-硫酸法测定洗脱峰,测得洗脱体积Ve。用蓝色葡聚糖(MW200万)求得外水体积Vo。用线性回归法得出回归方程y=-2.5903+3.1021 (=-0.9977)。按同样条件对待测样品进行柱色谱,由回归方程求得其分子量。 采用SDS法测定分子量 以牛血清白蛋白（单体MW68000 ）、鸡白蛋白（ 45000 ）、胰凝乳蛋白酶原（ 25700 ）、-乳球蛋白（18400）和溶菌酶(14300)作分子量标准。溴酚兰为指示剂，定其迁移率为1.0，以

19、各蛋白质相对迁移率对分子量对数作出标准曲线。根据样品的相对迁移率可求得其分子量。SDS两种方法的用途凝胶过滤法： 测定完整蛋白质的分子量 SDS： 测定蛋白质亚基的分子量(5)蛋白质二硫键分析 测定巯基的方法:DTNB（5,5-二硫基双-2一硝基苯甲酸法）：与巯基化合物反应时能生成一种黄色化合物，通过比色可进行定量PCMB（对氯汞苯甲酸法）：巯基抑制剂Changes in molecular mass/charge before and after reduction with DTT2.纯度分析2.1 目的蛋白质含量测定蛋白质浓度测定法: 凯氏定氮法、紫外光谱法、双缩脲法、染料结合比色法、福

20、林-酚法等。蛋白质纯度鉴定方法一览表基因工程产物中常见杂质检测方法 杂 质 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白 免疫分析 、SDSPAGE、 毛细管电泳(CE) 其他杂蛋白 SDS、HPLC、免疫分析、CE 残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 蛋白变异 肽谱、HPLC、等电聚焦(IEF)、CE 甲酰基甲硫氨酸 肽谱、HPLC、IEF、CE 甲硫氨酸氧化 肽谱、氨基酸分析、HPLC、质谱、 Edman分析 产物变性或聚合脱氨基 SDSPAGE、IEF、HPLC、CE、 Edman分析 单克隆抗体（亲和配基脱落） SDSPAGE、免疫分析氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、C

21、E、 Edman分析、质谱 2.2 杂质鲎试剂检测热原质 鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冻干品。 利用它对微量细菌内毒素（量）能形成凝胶的特点，检测热原质。 较之经典的家兔注射法快速、灵敏、简便，且省时、省工、省钱。 中国鲎 污染物 检 测 方 法微生物-（细菌、酵母、真菌） 微生物学检查 支原体 微生物学检查 病毒 微生物学检查 基因工程药物中常见污染物检测方法3.生物活性测定 动物体内试验（建立生物学模型） 细胞培养（计数法）进行体外效价测定。重组蛋白质是一种抗原,有相应的抗体或单克隆抗体,可用放射免疫分析法或酶标法测定其免疫学活性。采用国际或国家标准品,或经国家检定机构

22、认可的参考品进行校正标化。 干扰素生物活性测定 元. 转移因子生物活性测定 元.4.稳定性考察 药品的稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一,也是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据。 必须对产品在一致性、纯度、分子特征和生物效价等多方面的变化情况加以综合评价。 篇名 一种新剂型基因工程干扰素稳定性 的研究作者 邹钟诚 苏冬梅 高军 单位 沈阳三生制药股份有限公司 110141摘要 目前国内市场上的干扰素多数为含有人血白蛋白的冻干制剂，为消除人血白蛋白带来的血源性感染，并方便临床用药，我们根据基因工程药物的特点，将冻干基因干扰素改造成干扰素注射液，选择合适的缓冲系统和非人血白蛋白稳定剂，

23、在4和37下的稳定性进行研究，确定了一种稳定的新型干扰素注射液。关键词 基因工程干扰素；剂型；稳定性。5.产品一致性的保证 生产周期长（约一个月）,影响因素较多。从原料、生产到产品的每一步骤都进行严格的控制和质量检定,才能确保各批最终产品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准。 批次五、产品的保存 目的：防止变性、降解，保护活性中心1.液态保存 (1)低温保存 4 低温 或 -10 -20 冻存。 (2)在稳定pH条件下保存 pH一般在等电点附近。 (3)高浓度保存 保存时浓度不能太低,否则会引起亚基解离和表面变性。(4)加保护剂保存 蛋白质的稳定剂有糖类、脂肪类、蛋 白质类、多元醇、有机

24、溶剂等; 含有半胱氨酸巯基,加入B-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等。2.固态保存 固态蛋白质比液态稳定,含水量5%(水分测定仪),在室温或冰箱中保存均比较稳定。 最好的保存方法是把蛋白质制成冻干粉或结晶（4以下保存）。 小型冻干机 冷冻干燥仪FreeZone 6 Liter Freeze Dry Systems 重组人p53腺病毒注射液质量标准（2004）鉴别实验 - 酶切图谱分析; p53基因分析比活性纯度（260nm）效力试验 - 基因表活性病毒检测杂质检查：细胞蛋白（100ng/支）,细胞（10ng/支），小牛血清（50ng/支）无菌，毒性，内毒素等。 【商品名称】今又生【通用名称】重组人p53腺病毒注射液【英文名称】Recombinant Human Ad-p53 Injection【注册商标】今又生（Gendicine）【主要成分】重组腺病毒-p53基因颗粒【性状】本品为淡白色澄明液体【用法用量】在放射治疗前72小时开始瘤内注射。每周一次，每次1012VP，四周为一个疗程。根据病情，可使用1-2个疗程用前从-20取出，待完全融化后，轻轻混匀，尽量勿使药液沾染瓶盖。对直径4cm的肿瘤，用生理盐水稀释至4ml；对直径4cm的肿瘤，稀释至2ml，瘤组织局部多点注射【贮藏】-20保存【有 效 期】暂定三年（36个月）【包装】2ml西林瓶包装，每小盒装1支【价格说明】1900元