中药制剂分析新技术新方法课件

1、江苏食品职业技术学院医药系 祝冬青中药制剂分析新技术新方法中国药典中药分析方法发展趋势1977版药典收载显微鉴别1985版药典收载TLC鉴别1990版药典收载对照药材的TLC鉴别和色谱方法的含量测定2000版药典建立了以色谱法含量测定为主导的质控方法2005版药典大幅度增加HPLC方法，重视特征成分、活性成分的测定2010版药典增加了指纹图谱的测定趋势：新方法新技术不断引入中药的质量控制中。高效毛细管电泳2中药指纹图谱3中药化学指纹图谱技术、中药DNA指纹图谱技术现代色谱技术1顶空气相色谱法、超高效液相色谱、超临界流体色谱提纲 OUTLINE 1 现代色谱技术1、顶空气相色谱法（液上气相色谱法

2、、顶空分析法） 对样品基质上方的气体成分进行GC分析来测定这些组分在原样品中的含量顶空气相色谱的分类静态顶空GC动态顶空GC1、顶空气相色谱法主要特点：样品前处理简单检测限低可分析含量低、组成复杂的样品适用于易挥发或易分解或无法直接进样分析的液体或固体样品的分析 1 现代色谱技术 1 现代色谱技术2、超高效液相色谱（UPLC，Ultra Performance Liquid Chromatography）主要特点固定相双（三乙氧基硅）乙烷在硅胶中形成桥式乙基基团颗粒粒度小，仅为1.7m耐压，颗粒度分布范围很窄 1 现代色谱技术2、超高效液相色谱（UPLC，Ultra Performance L

3、iquid Chromatography）主要特点检测器响应快样品池10mm的光程（与普通HPLC相同）而体积只有500nL（普通HPLC的20分之一） 优点更高的分析速度，更好分离效果和更高的灵敏度，速度、灵敏度及分离度，分别是HPLC的9倍、 1.7倍及3倍 1 现代色谱技术3、超临界流体色谱（SFC, supercritical fluid chromatography）以超临界流体（低黏度、高密度以及较高的扩散系数）作为流动相。对GC及HPLC的检测器均可兼容使用适用于分析GC难以处理的高沸点、不挥发性样品分离速度较HPLC，分离效果更好。应用实例超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果

4、酸的含量 2 高效毛细管电泳电泳: 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象。 由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1937年 Tiselius (瑞典) 利用自由溶液电泳将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白1981年 Jorgenson 和 Luckas 发展了高效毛细管电泳分离分析技术 (使用75m内径石英毛细管和采用了高达数千伏的电压)， 2 高效毛细管电泳 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： + =电渗流 + +ef 阳离子运动方向与电渗流一致 - =电渗流 - -ef 阴离子运动方向

5、与电渗流相反 0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致 可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离分离原理 电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 2 高效毛细管电泳主要特点优点高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液 2 高效毛细管电泳常见的毛细管电泳模式毛细管区带电泳(CZE)毛细管胶束电动色谱(MECC)（胶束作为假固定相的电动色

6、谱）毛细管凝胶电泳(CGE)（凝胶作为支持物，起分子筛的作用）毛细管等电聚焦电泳(CIEF)（用于蛋白质、多肽等两性物质的分离）毛细管等速电泳(CITP)高效毛细管电泳法测定心舒口服液中腺苷、芦丁和阿魏酸的含量对照品溶液 （略）供试品溶液的配制取心舒口服液10 mL，加热浓缩至约1 mL，加60 %甲醇定容10 mL，冰箱放置过夜，经0. 45 mm滤膜滤过备用。电泳条件以熔融石英毛细管( 50 mm 66 . 5 cm，有效分离长度58 cm) 为分离通道，以105 mmol/L硼砂液为运行缓冲液，压力进样50 mpa，6 s，毛细管柱温度为20 ，运行电压为0 30 min : 24 kV

7、，30 60 min : 28 kV，检测波长为210 nm，毛细管柱使用前以0.1 mol/L 氢氧化钠溶液、注射用水和运行缓冲液依次冲洗5 ,5 ,8 min，每次电泳后以运行缓冲液冲洗8 min 。在此条件下，同时测定腺苷、芦丁和阿魏酸的含量。 3 中药指纹图谱 从整体上评价中药的内在质量中药（化学）指纹图谱法现代光谱（红外光谱，紫外光谱）色谱（气相色谱、薄层色谱、高效液相色谱、毛细管电泳）其它（X光衍射） 3 中药指纹图谱中药DNA指纹图谱法DNA分子遗传标记 DNA分子：遗传信息的直接载体，物种鉴别更为准确可靠90年代，PCR (Polymorase Chain Reaction)技

8、术，快速而灵敏地检测。近年来，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等检测DNA多态性的分子标记技术（DNA指纹技术）。应用：在药材鉴定方面广义的分子标记（molecular marker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类 限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。DNA序列测定基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。随机引物扩

9、增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR）2、DNA扩增产物指纹分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（58个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、特征扩增区段测序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位

10、点鉴定出来，可重复性高。基本原理 生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism,简称RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)Enzymes cut DNA at specific sequencesRestriction sites are often pal

11、indromes: 6-cutter GAATTC4-cutter TCGA CTTAAGAGCTDNA多态性根据其产生的两种基本方式碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的 。RFLP与镰状细胞贫血基本实验步骤靶DNA的准备 核酸探针的标记 杂交显示 RFLP的优点及局限性 优点： (1)普遍存在 (2)稳定性 (3)共显性 (4)探针与限制酶的组合数量无限 局限性： （1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变 （2）步骤多，工作量大，而且接触的

12、放射性污染也多 （3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别 （4）限制性内切酶价格较贵 RFLP用于亲缘关系分析“Ladder”RFLP在中药材鉴别中的应用 （一）近缘种的鉴别 如：海马的PCR-RFLP分析 （二）药用植物亲缘关系的研究 如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生 物碱分布的关系 RAPD技术及其应用 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出

13、现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。RAPD技术基本原理RAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Williams称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(Arbitrary Primer PCR)，引物为2030个碱基。对于任一引物，如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。RAPD: rando

14、mly amplified polymorphic DNA基本实验步骤 模板DNA的制备 PCR扩增，通常RAPD扩增条件为：93预变性200s，开始如下循环：94变性lmin，36退火1min，72延伸2min；经过40个循环后，72延伸5min，循环结束后反应产物置于4保存。 扩增产物20l反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况 RAPD图谱的数据处理 RAPD分析的优越性和不足优越性： (1)无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，也无需专门设计RAPD扩增反应的引物，引物随机合成或是任意选定的,长度一般为9-10个寡核苷酸； (2)扩增没有特异性； (3)退火温度较低，一般为3

15、6，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。 (4)简便易行，省力省时。 （5）检测灵敏方便； （6）所需样品DNA量极少，仅为10ng,为RFLP的1/l000l/2000。 （7）能自动化。不足： （1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复； （2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高； （3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物； （4）

16、RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。RAPD分析在中药研究中的应用 道地药材的评价 例：当归药材道地性的RAPD分析野生与栽培种及不同农家品种 亲缘关系分析 例：人参及山参RAPD指纹动物药的鉴定 例：蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究 AFLP技术及其应用 扩增酶切片段多态性 (Amplified Restriction FragmentPolymorphism)是一种基于PCR的DNA指纹技术 ，AFLP是近几年来继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术。被誉为新一代的分子标记技术，近年来已得到广泛的应用。 AFLP基本原理 AFLP的基本原理是对基

17、因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。 先将基因组DNA用限制性酶消化，产生粘性末端。然后使用人工合成的双链接头（artificial adapter）,与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。 基本实验步骤 模板的制备：即DNA酶切及人工接头的连接（Restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters） 限制性片段的选择性扩增（Selective amplification of sets

18、 of restriction fragments） 扩增产物凝胶电泳分析（Gel analysis of the amplified fragments） AFLP的实验过程AFLP反应流程：AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 DNA片段的预扩增。 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。AFLPs荧光标记全自动AFLPFor ABI 377 DNA Sequencer and AFLP KitsAFLP技术特点扩增效率高，多态性比例高 AFLP标记稳定可靠，不受基因组来源和复杂度的影响，没有种属特异性 AFLP技术较简便易行，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，对模板浓度的变化不敏感，允许一定程度的共扩增，且只需要极少量的DNA材料 AFLP是一项专利技术，受专利权保护，其分析试剂盒价格偏高 AFLP的重复性问题Jones et al.（1997）同一实验在欧洲的8个实验室重复