微生物与基因工程课件-2

1、第十章 微生物与基因工程第十章 微生物与基因工程 基因工程(genetic engineering)或重组DNA技术(combinant DNA technology) 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。克隆(clone): 无性繁殖系的意思。 基因工程(genetic engineering一、基因工程的发展历史 G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977 美国南旧金山由博耶和

2、斯旺森建立世界上第一家遗传 工程公司, 专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物1980 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997 英国罗林研究所成功的克隆了多莉第一节 基因工程概述一、基因工程的发展历史 G.J.Mendel的豌豆杂交试验 二、基因工程的基本过程 1.分离或合成基因； 2.通过体外重组将基因插入载体； 3.将重组DNA导入细胞； 4.扩增克隆的基因； 5.筛选重组体克隆； 6.对克隆的基因进行鉴定或测序； 7.控制外源基因的表达； 8.得到基因产物或转基因动物、转基因植物。 二、基因工程的基本过程 1.分离或合成基因； 1.将目的基因与运载体DNA在体外进行

3、重组目的基因载体DNA限制性核酸内切酶DNA 重组体引入宿主细胞筛选含有重组体的细胞无性繁殖扩增、基因表达、纯化产物2.转化或转染3.筛选4.克隆（cloning）表达1.将目的基因与运载体DNA在体外进行重组目的基因载体DNA1、获取 DNA重组基本过程1、获取 DNA重组基本过程2、重组2、重组3、转化3、转化4、筛选4、筛选5、克隆5、克隆6、表达表达产物分离纯化6、表达表达产物分离纯化三、微生物学与基因工程的关系2.克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；3.工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化的；4.微生物细胞是基因克隆的宿主；5.大多数基因产品都是通过微生物发酵生产；1.微生物的

4、多样性为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；6.有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自对微生物的研究。 三、微生物学与基因工程的关系2.克隆载体主要是用病毒、噬菌体第二节 基因的分离、合成和定位诱变一. 从基因文库或cDNA文库中分离目的基因1.从基因文库中分离目的基因 1）基因组文库的构建 基因组文库就是指基因组DNA片段的全部克隆。即将整个基因组用合适的限制性酶切成合适长度的片段，并用一种载体将全部片段进行克隆，文库中每一个克隆只含基因组某一特定的DNA片段。第二节 基因的分离、合成和定位诱变一. 从基因文库或cDN制备基因组DNA文库分离、纯化基因组DNA 条件：温和，在EDTA

5、或SDS等存在下 限制酶部分消化 用蛋白酶K消化细胞、酚抽提大小不同DNA酶切片段 片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离 分别与同样RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 DNA连接酶连接。 导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。 筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。 制备基因组DNA文库 理想的基因组文库应包含该生物基因组全部遗传信息。 通常基因组越大需要的克隆数越多，要求库容量也越大。基因组文库的大小的估算：N=ln（1P）/ln（1 f）N：为基因组文库必需的克隆数目。P：为文库中含目的基因DNA片段的出现概率。f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。 理想的基因组文库应包含该生物

6、基因组全部遗传信DNA 文 库DNA 文 库2.从cDNA文库中分离目的基因 cDNA文库是指生物mRNA的全部cDNA克隆。文库中每个克隆只含一种mRNA信息制备cDNA文库（1）由mRNA合成cDNA第一条链（2）合成cDNA第二条链（3）构建cDNA文库2.从cDNA文库中分离目的基因 cDN 分离目的基因 的mRNA逆转录生成cDNA单链 水解去除mRNA， 合成cDNA双链 水解回折处单链得到平端双链cDNA导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库 导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库3 从基因文库中筛选目的基因 根据目的基因序列，设计制备并标记特异探针与DNA杂交或PCR方法，可从文库中筛

7、选出目的基因。3 从基因文库中筛选目的基因 根据目的基因序列，设计 用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段。二、 基因的化学合成 用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白三 PCR 扩增基因PCR扩增仪 1984，穆利斯（Mullis）发明了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。三 PCR 扩增基因PCR扩增仪 1984，穆利微生物与基因工程课件_2 1. PCR扩增原理 引

8、物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列。 如果DNA片段两端的序列是已知的，可采用PCR将此DNA片段扩增出来。 PCR过程需要合成两个寡聚核苷酸作引物，并各自与所要扩增的靶DNA片段的末端互补。PCR扩增分三步 1. PCR扩增原理 引物与模板 (1)变性(denaturation) 加热，模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。9296 (2)退火(annealing) 温度下降，寡核苷酸引物与模板DNA中所要扩增序列两端的碱基配对。 4060 (3)延伸(extension) 在适宜条件下，引物3端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。6572 DNA

9、片断呈2的指数增长，12h重复2030次循环，DNA扩增至106107。 (1)变性(denaturation) PCR循环-变性PCR循环-变性PCR循环-变性PCR循环-变性PCR循环-变性PCR循环-变性PCR循环退火PCR循环退火PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸PCR循环延伸 2. 来自微生物的耐高温DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶：1988，从水生栖热菌(Thermus aquaticus) 中分离， 在95温度下保持稳定，在高温下以单链DNA为模板合成互补链，一次加酶可满足PCR全过程需求。缺乏校正功能。 PfuD

10、NA聚合酶和Vent DNA聚合酶：是一类既耐热又具校正功能的酶，提供了PCR产物的特异性。Pfu是从火球菌（Pyrococcus Furiosus）中分离的。 VentDNA聚合酶从极端耐热菌中分离的。 Tth DNA聚合酶：同时具有逆转录酶活性。可使RT-PCR在同一体系中进行，先将RNA逆转录成DNA，作为PCR的模板，再进行PCR。从嗜热菌中分离 2. 来自微生物的耐高温DNA聚合酶 Taq 3. PCR技术的应用 （1）可用于DNA的扩增和克隆：制备单链或双链DNA探针；基因拼接、定位诱变和DNA测序；转基因动、植物。 （2）在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，以及对癌基因的分

11、析确定。 （3）用于法医，以鉴别个体和判定亲缘关系。 （4）动、植物检疫。 3. PCR技术的应用 （1）可用四. 基因的定位诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 1)寡核苷酸指导的定位诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。 祥见p272四. 基因的定位诱变（site-directed mutag微生物与基因工程课件_22)盒式诱变(cassette mutage

12、nesis)2)盒式诱变(cassette mutagenesis)3）PCR定点诱变3）PCR定点诱变一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)第三节微生物与基因工程工具酶 简称限制性酶(restriction enzyme)是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。 在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统。 限制酶分为、III三种类型，通常所说的限制性核酸内切酶，即指型限制酶。一、限制性核酸内切酶(restriction endonuc 1.命名 EcoRI E：大肠杆菌属名第一个字母； co：种

13、名头两个字母； R：株名； I：该菌中第一个被分离出来的酶。 副溶血嗜血杆菌的酶表示为Hph I (Haemophilus parahaemolyticus) 副流感嗜血杆菌的酶表示为Hpa I (Haemophilus parainfluenzae) 属名相同，种名头四个字母相同，第三个字母用种名后的另一个字母代替。 1.命名 EcoRI 副溶血嗜血杆菌的酶 2.限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列通常由48个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，呈回文结构。 回文结构是指双链DNA中含有二个结构相同、方向相反的序列也称为反向重复序列。 例如： 5-GGTACC-3 3-CCATGG-5 2.限制

14、性核酸内切酶的基本特性 赏花归去马如飞， 去马如飞酒力微； 酒力微醒时已暮， 醒时已暮赏花归。 暮 已赏 时花 醒归 微去 力马 酒如 飞回文诗赏花归去马如飞， 所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端。(1)形成粘性末端（2）形成平末端 所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基平端切口粘端切口平端切口粘端切口基因组不同长度的酶切片段可用凝胶电泳区分开基因组不同长度的酶切片段可用凝胶电泳区分开 二、DNA连接酶 催化两个双链DNA片段相邻的5磷酸与3羟基之间形成磷酸二酯键。 T4DNA连接酶：通常催化粘性末端间的连接效率要比催化平末端连接效率为高。 大肠杆菌DNA连接酶：

15、不能催化DNA分子的平端连接。 二、DNA连接酶 催化两个双链DNA片段相邻的5第四节 微生物与克隆载体 克隆载体的基本要求： 能够进行独立自主地复制； 含有多克隆位点，即具有若干限制酶的单一切点，便于外源基因的插入； 具有可供选择的遗传标记。 克隆载体(cloning vector)：负责将外源基因送入宿主细胞并进行复制与 扩增的运载工具。 具有一定的安全性，在胞内不发生重组和转移，在胞外不自由扩散。第四节 微生物与克隆载体 克隆载体的基本要求：一、质粒载体（1）环状双链的DNA分子，由4361bp组成；（2）可插入小于5kb左右的外源DNA；（3）是松弛型质粒，在细胞中有较高的拷贝数； p

16、BR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒载体。（4）具有四环素(Tetr)和氨苄青霉素 (Ampr)两种抗性基因；（5）有24种限制酶的单一切点，其中7种位于四环素抗性基因之内，3种位于氨卡青霉素抗性基因之内。一、质粒载体（1）环状双链的DNA分子，由4361bp组成；氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因 二、噬菌体载体 （1） 噬菌体载体优点 寄主大肠杆菌；线状双链DNA ，大小约50kb DNA两端有12个核苷酸互补，形成粘性末端（cos位点），进入寄主后形成环状双链DNA。 分子遗传学背景十分清楚； 容量较大，能容纳大约23kb的外源DNA片段； 具有较

17、高的感染效率，几乎可达100%（质粒转化率只有0.1%）。 二、噬菌体载体 （1） 噬菌体载体优点 插入外源DNA的长度受到一定限制，因为噬菌体头部容纳DNA的量是一定的，否则不能正常装配。 （2） 噬菌体载体缺点 插入外源DNA的长度受到一定限制，因为噬菌体头部容 具有克隆大片段外源DNA的能力。 柯斯质粒本身一般只有57kb左右，而它克隆外源DNA片段可达35-45kb。常用于构建基因文库。优点： 具有噬菌体的高效感染力，在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体，仅以质粒形式存在；三、柯斯质粒载体(cosmid vector) 即黏粒载体，由噬菌体的粘性末端cos位点和质粒构建而成。 具有克隆大片

18、段外源DNA的能力。 柯斯质粒本 四、M13噬菌体载体 突出优点是用于制备测序用的单链DNA、单链DNA探针、定位诱变模板，也可用于噬菌体展示。 1. M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp，只感染雄性大肠杆菌（F+或Hfr），通过性纤毛进入宿主细胞成为复制型dsDNA，滚环复制产生ssDNA； 2. M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段； 四、M13噬菌体载体 突出优点是用于制备测序用的单 五、噬菌粒载体 噬菌粒(phagemid)是由M13噬菌体和质粒DNA融合而成,含有M13的复制起点和质粒的复制起点、选择标

19、记和多克隆位点。 优点： 载体本身分子小，约为3kb，便于分离和操作； 可克隆l0kb外源DNA片段，克隆能力比M13大； 可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。 五、噬菌粒载体 噬菌粒(phagemid)是由M1微生物与基因工程课件_2 六、真核生物的克隆载体 1.酵母质粒载体 酵母质粒载体都是利用酵母的2m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的。能分别在细菌和酵母菌中复制属于穿梭质粒。 六、真核生物的克隆载体 1.酵母质粒载体2.Ti 质粒载体 Ti质粒是植物基因工程的理想载体，根癌农杆菌含有的Ti质粒，大小约200kb。当它感染植物时，Ti质粒中的T-DNA 区段可转移并整合到植

20、物细胞的基因组DNA中。 3.真核生物病毒载体 哺乳动物病毒（SV40、腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒），昆虫，植物病毒， 经改造后都可作为基因载体。2.Ti 质粒载体 Ti质粒是植物基因工程的理想载体， 七、人工染色体 1.酵母人工染色体（ yeast artificial chromosome, YAC ） 为了研究真核生物基因组的结构，需要克隆较大的DNA 片段，一般的质粒和病毒载体不能达到要求，利用染色体DNA 的结构构建了人工染色体，可携带较大DNA片段。 七、人工染色体 1.酵母人工染色体（ yea 酵母人工染色体是目前能容纳最大外源 DNA 片段的人工构建载体。YAC含有构成酵母染

21、色体的3个必要单元： 着丝粒（ centromere, CEN ），保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞； 端粒（ telomere, TEL ），位于染色体两个末端， 防止染色体 DNA 复制过程中两端序列的丢失，保证DNA正常复制； 酵母自主复制序列（ autonomously replicating sequence, ARS ）其功能与酵母细胞复制有关此外还有限制酶切位点和选择标记基因。 酵母人工染色体是目前能容纳最大外源 DNA YAC 克隆外源 DNA 能力非常大，一个 YAC 可插入长达 106 碱基以上 DNA 片段。因此 YAC 既保证所插入外源基因结构的完整性，又大

22、大减少基因库所要求克隆的数目。目前 YAC 已成为构建高等真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。 YAC 克隆外源 DNA 能力非常大，一能携带约300kb大片段DNA。 2. 细菌人工染色体（ BAC ） 以F因子为基本骨架构建。主要用于基因组文库构建、大基因簇研究和各类基因组计划中。 能携带约300kb大片段DNA。2. 细菌人工染色体（ BA八、外源基因与载体体外连接（主要有以下4种连接方式） 1) 黏性末端连接效率高 2）人工接头法 3）均聚物加尾法 4） 平头末端连接八、外源基因与载体体外连接（主要有以下4种连接方式）一、克隆宿主的基本要求能够高效吸收外源DN

23、A；不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；一般为重组缺陷型(RecA-)菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；具有使外源DNA进行高效复制的酶系统便于进行基因操作和筛选；具有安全性:宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。第五节 外源基因导入寄主细胞一、克隆宿主的基本要求能够高效吸收外源DNA；第五节 外大肠杆菌作为宿主的优缺点 优点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚等。 缺点：条件致病菌和产生内毒素。 一些诱变的大肠杆菌已解决了以上大部分问题。 1.原核生物宿主 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 2

24、.真核生物宿主 酿酒酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞。大肠杆菌作为宿主的优缺点 优点：生长迅速、极易培养、能1、外源基因导入原核细胞1.转化： 在原核生物中，通过将外源DNA导入受体细胞，从而获得新的遗传物质的方法。如氯化钙法。二 外源基因导入寄主细胞的方式1、外源基因导入原核细胞1.转化： 在原核生物中，通过将外源2.转导: 以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状.2.转导: 1）酵母 (1) 原生质体法 (2) 离子溶液法 (3) 电穿孔法 (4) PEG1000法2.外源DNA导入真核细胞1）酵母2.外源DNA导入真核细胞

25、2）外源基因导入动物细胞：磷酸钙共沉淀法DEAE-葡聚糖法电穿孔法脂质体法动物病毒法显微注射法 2）外源基因导入动物细胞：3）外源基因导入植物细胞 农杆菌法：Ti质粒即tumor-inducing plasmid3）外源基因导入植物细胞基因枪法：使用高能微粒子轰击将DNA导入细胞或活的组织内。亚微粒的钨和金能自发地吸附DNA，将这些微弹加速到很高的速度轰击细胞 基因枪法：使用高能微粒子轰击将DNA导入细胞或活的组织内。 基因枪 基因枪电转仪电转化电转仪电转化 三、目的克隆的筛选和鉴定1.载体上选择标记的鉴定 从众多克隆中筛选和鉴定含有目的基因的重组体克隆，通常有3类鉴定方法：1）抗生素平板法

26、因为自身环化的载体和为被酶解的载体的转化细胞，在抗生素平板上也能生长，所以假阳性率较高。 外源基因插入载体的位点位于载体抗生素抗性基因之外，将转化后的重组体细胞置于含有抗生素的平板上，仍可长出菌落。 三、目的克隆的筛选和鉴定1.载体上选择标记的鉴抗Amp宿主细菌含Amp培养基抗Amp宿主细菌含Amp培养基 外源DNA插入位点位于载体的抗生素抗性基因之内，转化后的重组体在含该抗生素的平板上不能够生长。2） 插入失活法 含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，可以在含有四环素或氨苄青霉素平板上生长， 外源DNA插入位点位于载体的抗生素抗性基因之内3）-半乳糖苷酶显色反应法-互补(蓝白筛选) 某些载体，如

27、M13噬菌体、pUC和pGEM等质粒，携带lacZ 基因的一段序列编码-半乳糖苷酶的肽，而受体细胞为lacZ 基因突变株，无-半乳糖苷酶活性，但遇肽，可发生互补作用，产生具有活性的酶，使培养基中的无色物质X-gal 分解成半乳糖和蓝色的5-溴-4氯靛蓝，使菌落呈蓝色；外源基因插入位点在载体的lacZ 基因内，失去互补作用，结果带有外源基因的菌落呈白色。3）-半乳糖苷酶显色反应法-互补(蓝白筛选) 大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，但利用乳糖的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会合成。大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因:Z、Y和A。它们被同一个转录单元lacZYA编码，共有一个启动子。lacZ 编码-半乳糖苷酶，将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。lacY 编码半乳糖苷通透酶，将乳糖运送透过细菌的细胞壁。lacA 编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶。