DNA计算中荧光技术的应用及其发展

1、计算机学报2009年12期，2009，32（12）DNA计算中荧光技术的应用及其发展张成 杨静 王淑栋 (北京大学信息科学技术学院，高可信度软件技术教育部重点实验室，北京 100871)摘要：DNNA计算算作为前前沿科学学研究的的重点和和热点，已已经从简简单发展展为复杂杂，从理论转化为应应用。在在这一过过程中，反反应速度度快，变变化灵敏敏的荧光光标记技技术发挥挥了重要要的作用用。本文文围绕DNNA计算算和荧光光标记技技术两个个方面进行行说明。一方面，对近年来DNA计算中荧光技术的应用进行了总结：（1）荧光标记的表面计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术

2、。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术。另一方面，介绍了几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。在今后的研究中，只有将这两者紧密结合，才能发挥DNA计算天然的优势。关键词：DDNA计计算；荧光标记记技术；纳纳米技术术；DNNA分子子；杂交交 1 引言DNA由于于其具有有的特性性，在大大自然的的进化中中，被选选择为稳稳定的遗遗传物质质。在细细胞中，DNA精细地编码并控制

3、着整个细胞的新陈代谢。另一方面，DNA分子容易构成二级甚至三级结构。因此，DNA作为计算工具有着得天独厚的优势1,2。近年来，DNA计算领域发展迅速，尤其在DNA分子自组装、DNA纳米装置等方面3。然而伴随着DNA计算解决问题的规模增大和形式多样化，求解过程中DNA分子数量急剧增加以及DNA分子结构复杂性的加大，求解过程中实验过程繁琐且存在误差，使得DNA计算中解的标记和检测变得更加困难4。为了解决这一难题，荧光技术在DNA计算中逐渐得到了广泛的应用。荧光是指某些物质受到某种波长的光激发后，其原子中的电子被激发到较高能级，产生的发射光。荧光物质分子都具有刚性结构和共平面的-共轭体系。在激发态时

4、，这种结构具有稳定性，可以持续数秒钟，从而有利于能量的转移5。DNA荧光技术在生物学领域中已经有很多应用，如近年来发展起来的DNA荧光标记、real-time检测技术、分子信标技术等。荧光标记DNA简单便捷，可以实时检测，而且灵敏度非常高，这些特点都使得其在DNA计算中具有广泛的应用前景。目前，结合合荧光技技术的DDNA计计算已经经成为前前沿研究究热点。荧光技技术在DDNA计算算中的应应用主要要有如下下几类：（1）荧光光标记的的表面计计算：通通过DNNA固定定化和杂杂交技术术，在固固相表面面通过荧荧光标记记进行计计算。（2）与某些些酶切技术术相结合合的荧光光检测：利利用特定定酶与DDNA分分子

5、的特特性，通通过检测测酶切后后荧光量量进行计计算。（3）与DNNA链置置换相结结合的荧光技术术：巧妙妙利用DDNA分分子的三三链甚至至多链结结构，通通过加入入引发链链，来释释放另一一DNAA链。（4）与基基因沉默默技术相相结合的的荧光DDNA逻逻辑门：利用RRNAii技术控控制表达达荧光蛋蛋白，从从而构建建了多重重逻辑门门。（5）与DNNA自组组装立体体结构相相结合的的荧光技技术：在DNAA自组装装结构的的基础上上，结合合了荧光光标记技技术。（6）与DNNA变构构相结合合的荧光光技术：通过DDNA分分子的不不同状态态，构建建了可控控的荧光光纳米装装置。近年来，荧荧光技术术不仅应应用于生生物学本

6、本身，而而且在DDNA计计算、信信息学等等诸多领领域具有有很大的应用潜力力。下面面有几种近近年来发发展起来来的新型型荧光技技术：（1）荧光光信号识识别放大大技术。（2）与磁磁珠技术术相结合合的荧光光技术。（3）与PHH值变化化相结合合的DNNA荧光光技术。（4）与miiRNAAs检测测相结合合的荧光光技术。相信随着DNA计算和荧光技术的发展，这两者必将紧密结合，使得DNA计算的种类和方法更加多样和成熟。2 DNAA计算中中荧光技技术的应应用2.1荧光光标记的的表面计计算DNA表面面计算其其基本原原理是：通过DNNA固定定化和杂杂交技术术，将代代表所有有可能存存在解的的不同DDNA序序列固定定在

7、固相相表面，然然后通过过多次的的杂交以以及降解解过程来来筛选正正解。通通过荧光光标记可可以检测测每次和和最终计计算的结结果。220022年，Addlemman组组使用杂杂交池完完成了一一个200个变量量的3可满足足性问题题6。20004年XinngPiing Su等等在20000年年Liuu7的工作作基础上上，设计计了一种种通用型型的DNNA表面面计算模模型8。同年，KKrisstiaane A. Schhmiddt等利利用单分分子杂交交荧光标标记技术术4个变量量的可满满足性问问题9。下面以20000年年，Liiu 等等发表在在natturee上的DNNA表面面计算经经典实验验为例，说明其其解

8、决SAAT问题题的过程程7。由于该该问题共共有166种可能能性，故故将代表表着不同同可能解解的DNNA片段段固定在在固相表表面。在在每一次次的杂交交筛选过过程中，加入与固定DNA链特异性互补的DNA。那末，被杂交的固定DNA链变为双链，而未互补的单链DNA则被核酸外切酶降解。通过数次操作，存在于固相表面的DNA链就是每次经杂交而保留下来的DNA链，也就是代表正解的DNA链。该实验中，荧光技术主要应用在解检测的过程中：使用一条生物素标记的引物和另一条荧光标记的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段为模版，进行PCR。利用磁珠将PCR双链产物吸附，再分离双链，分离出荧光标记的ssDNA。将这些ss

9、DNA与经过多次杂交筛选的固相杂交，只有哪些存留在固相表面的DNA链可以杂交上，于是特定的位置就可以检测到较高荧光强度。 图1-1 实验示示意图 图1-2 列阵荧荧光检测测结果2.2 与与某些酶切切技术相相结合的的荧光检检测利用酶与DDNA分分子的特特性，通通过检测测酶切后后荧光量量进行计计算。其其实就是是利用某某些酶与与DNAA分子空空间结构构的相互互作用，再再结合荧荧光技术术来共同同实现的的。这种种方法具具有灵敏敏度高，反反应速度度快等特特点。其其最大的的优点就就是巧妙妙地将酶酶的生物物特性与与计算问问题相结结合，极极大地丰丰富了DDNA计计算的手手段。2001年年，Waang等等在上述述

10、表面计计算实验验的基础础上对解解的检测测又进行行了新的的改进，即即将酶切切和荧光光技术相相结合110。通通过上述述核酸外外切酶的的方法，利利用新技技术完成成单链DDNA的的解的检检测。其其基本思思想如下下：左侧侧DNAA探针的3端至至少和右右侧杂交交的DNNA探针针有一个个碱基的的重合，并使得右侧探针有5端呈单链状态。此时右侧探针由两部分组成：一部分是和目标序列形成双链的；另一部分则是由非互补的5端DNA链组成（见图2A）。此时该非互补的5端DNA臂会覆盖在上游寡核苷酸链上，与左侧探针至少有一个重合的碱基。恰恰在这重合的位置，可以形成酶切位点。因此，非互补的5端DNA臂可以被切割而释放。利用这

11、一原原理，结结合荧光光技术，如如图所示示，将荧荧光基标标记在非非互补DDNA链链的5端，而而将荧光光淬灭基基标记在在重合的的酶切位位点3端方向（见见图2B）。这样样，只要要酶切位位点被酶酶切，标标记有荧荧光基的的非互补补的5端DNAA链就会被被释放，从从而与荧荧光淬灭灭基分离离，使得得荧光释释放量大大大提高高。这种种方法可可以有效效检测目目的片断断是否存存在。文文中还将将PCRR方法检检测目的的片断与与这种荧荧光检测测法进行行了对比比，发现现该方法法比PCCR检测测具有更更高的灵灵敏度。图2 实验验原理示示意图 图3 几种种逻辑门门的构成成示意图图Milann N.等20003年研研制了一一种

12、名为为MAYYA的游游戏。这这是一种种利用特特殊的DDNA酶酶E6（一种依依赖于DDNA的的RNAA酶）构建起起来的逻逻辑门111。这种酶酶识别的的DNAA底物要要求具有有特殊结结构（如如3a图所示示）。只有当当上部寡核核苷酸探探针与E6的支支架区互互补，上上部寡核核苷酸才才能被切切断释放放。将寡寡核苷酸酸两端分分别标记记荧光淬淬灭基（如如罗丹明明）和荧荧光基，那那末只有有寡核苷苷酸探针针被切断断释放，荧荧光基才才能有效效激活并并释放荧荧光。这这是MAAYA游游戏进行行逻辑判判断的主主要检测测手段。构建有效的空间位阻是实现这个检测手段的关键。当寡核苷酸探针的结合使绿色标记的位阻消失的时候，加速

13、酶切反应；当寡核苷酸探针的结合使红色标记的位阻消失的时候，降低酶切反应。基于以上原原理，构构建出以以下几种种逻辑门门：YEES型、NOOT型、ANND型和和ANDD-ANND-NNOT型型。YEES型逻辑门门（图3bb所示），当i1寡核核苷酸加加入时，消消除原来来i1环状状结构，从从而标记记的荧光光探针可可以与之之结合，并并且被切切除释放放。其判判断过称称为加入入i1，荧荧光输出出。NOTT型逻辑辑门（图图c所示）。当当加入ii6时，环环状结构构打开，荧荧光结合合的寡核核苷酸探探针无法法结合在在互补区区域，于于是无荧荧光输出出。其判判断过程程为加入入i6，荧荧光输出出停止。AND型逻辑门（图d

14、所示）实际上是将两个YES型逻辑门组装在一起。也就是说，只有当i1和i6都被加入时，才能有荧光输出。AND-AND-NOT型逻辑门（图e）是更为复杂的组合体。必须同时加入i1和i3，才能输出荧光。然而，只要有i6存在，就不会输出荧光。文中解决的问题是在33的棋盘中完成3个棋子同线相连。考察所有的逻辑情况后，将所有可能的逻辑门都提前置于棋盘的网格中。再将代表棋子的寡核苷酸分别放入，然后观察荧光输出情况进行判断。2.3 与与DNAA链置换换相结合合的荧光光技术该技术多用用来构建建DNAA逻辑门门。其巧巧妙利用用DNAA分子的的粘贴，通通过加入入引发链链，来释释放另一一DNAA链。在逻逻辑计算算中，

15、这这种技术术具有循循环性、自自引发性性、反馈馈性、灵灵敏性和和准确性性等特点点。近年年来在sscieencee等高水平平科研杂杂志上都都发表了了大量系系列工作作，而且且在生物物检测领领域具有广泛泛的实际际应用前景景。20000年，Beernaard Yurrke构构建了一一种DNNA链置置换机器器，在置置换过程程中可以以实现闭闭合式运运动12。20003年，B. Yuurkee等构建建了一种种基于DDNA链链置换的的纳米机机器13。Jonng-SShikk Shhin等等利用可可反复的的DNAA链置换换，构建建了可以以反复读读取和输输入的三三状态存存储器114。20006年，Geeorgg S

16、eeeliig等对对DNAA链相互互粘贴、置置换的几几种模式式进行了了实验115。20006年，Siimonn J. Grreenn等用茎茎环结构构实现了了DNAA链的粘粘贴互换换16。20007年，Daavidd Yuu Zhhangg等实现了了DNAA链置换换的循环环进行117。20007年,suuvirr veenkaatarramaan等实实现了通通过DNNA链自自粘贴来来完成多多段DNNA聚合合延伸118。下面介介绍两个具有有代表性性的工作作。2006年年，Geeorgg seeeliig 等等报道了了一种没没有酶参参与的DDNA逻逻辑门119。其基本本原理如如图4-1所示示，即先先

17、构建好好由寡核核苷酸链链G、Eoutt、F共同杂杂交组成成的DNAA互补结结构，再再加入GGin寡核核苷酸链链。此时时，由于于Gin一侧侧末端和和G的一侧侧单链末端端互补，从从而使逻逻辑门中中的G寡核苷苷酸链被释放放，与GGin形成成互补双双链。此此时的互互补结构构中，只只剩下了了寡核苷苷酸链EEoutt和F。然后后再加入入Fin寡核核苷酸链链，Fin的一一侧末端端与F中间有有互补序序列，加加之Eoutt本身形形成的是是单链环环状的不不稳定结结构，于于是，FF和Fin结合合成双链链。Eoutt寡核苷苷酸链被被释放。文文中使用用了荧光光标记地地对Eoutt的释放放情况进进行了检检测（如如图4-2

18、所示示）。Eq末端标标记有荧荧光基，而而Ff末端标标记有荧荧光淬灭灭基。当当其互补补结构存存在时，荧荧光恰被被淬灭，从从而无法法检测。但但是，当当Eq和Ff分离时时，荧光光就被释释放出来来，从而而表明DNNA链的的分离情情况。上上述由G、Eoutt、F的DNAA互补结结构就可可以构成成与门。也也就是说说，只有有同时加加入Gin和Fin，才才能诱发发释放出出荧光。值得注意的是，文章并不只是提出这种DNA计算逻辑门，而是将其应用到生物基因检测的中。在鼠脑总RNA中，成功的检测了数个基因的表达情况。图4-1链链置换原原理示意意图 图图4-22荧光标标记原理理示意图图2008年年，Peeng Yinn

19、等对这这种DNNA自粘粘贴、链链置换进进行了更更为精细细的研究究20。其主要要原理是是利用DDNA茎茎环结构构的链置置换。如如图5-1所示示，茎环环结构AA是由att、a、b、bt、ct、c等DNAA序列构成成的，在在茎环结结构末端端有未互互补的单单链DNNA区域域。如果果加入与末末端单链链DNAA互补的的序列，整整个茎环环结构就就会打开开（图中的的at与at*可以互互补，其其它同理理）。因此此，当体体系中只只加入AA、B这两种种茎环结结构时，相相互之间间无任何何影响。但但是，当当体系中中加入了了寡核苷苷酸链I后，就就触发了了整个循循环。II先和A末端互互补，使使得A的茎环环结构打打开。此此时

20、，AA的Bt区域域与B的Bt*相互作作用，使使得B的茎环环打开。当当B完全打打开后，B的a*区域会与I竞争A的a区域形成互补结构。被置换掉的I就可以重新激发新的循环。 在在上述基基础之上上，Peeng Yinn等设计计了多种种复杂结结构的实实验：直直线型、回回路型、支架型、自动位移型（见图5-2）。直线型指I与A、B、C组件是逐级触发，形成串联关系。回路型指参与的激发物在循环结束后又被释放，从而再次作用于系统。并且构建了多个循环相互镶嵌的复杂体系。支架型指在整个触发过程中，不仅是线性的作用方向，而且是向二维平面的扩展。自动位异型则是用链置换实现了特定DNA序列的位移。在这些实验中，荧光技术发挥

21、了重要的作用。其中主要是将荧光基标记在茎环的一端，另一端则标记有荧光淬灭基。只有茎环结构打开，才能够检测到相应的荧光。根据标记不同的荧光，可以了解整个循环的反应速度，和反应程度。尤其是在自动位移型实验中，通过检测荧光，可以得知特定DNA序列在特定时间移动的位置。图5-1 茎环结结构DNNA置换换原理 回回路型直线型自动位移型型 支架型型图5-2 几种复复杂类型型：直线线型、回回路型、支支架型、自自动位移移型2.4 与与基因沉沉默技术术相结合合的荧光光DNAA逻辑门门2007年年，keelleer等创创造性地地使用活活体细胞胞，利用用RNAAi技术术，通过过控制特异异基因的的表达，构构建多重重逻

22、辑门门。这种技技术将DDNA计计算和基基因表达达、疾病病诊疗有有机的结结合在一一起，为为DNAA计算的的应用指指出了另一一方向221。RNAi技技术是近近年来发发展起来来的特异异性沉默默基因技技术，其其基本原原理就是是将想敲敲除的基基因序列列或者部部分序列列构建到到特定载载体中，经经过转录录，形成成部分序序列的反反义RNNA（还还可以通通过直接接加入特特异的反反义短寡寡核苷酸酸进行基基因敲除除）。这这些RNNA很快快就可以以被酶解解为小片片段，并并与相关关的蛋白白质形成成复合体体。于是是，这种种复合体体就可以以根据RRNA来来识别特特定的mRNNA，从从转录水水平消除除特定基基因。kellee

23、r等利用载载体序列列的线形形串联排排列以及及基因表表达的调调控原理理（非翻翻译区UUTR对对下游基基因转录录的影响响），构构建了多多个逻辑辑门模型型。（1）或门，如如图6-1a所示，mmRNAA1和mRNNA2分分别与荧荧光蛋白白基因串串联。这两个个mRNNA只要要有一个个正常转转录表达达，就会会有荧光光蛋白输输出。因因此，形形成了“或”的关系系。（2）与门，如如图6-1b所示，TTargget A、Tarrgett B序列是是串联分分布。假假设有AA、B两种内内源物分分别抑制制siRRNA-A和siRRNA-B对TarrgettA、B的影响响。那末末只有同同时加入入A、B时，才才能完全全抑制

24、RNNAi作作用，也也就是说说，此时时荧光蛋蛋白才能能正常表表达。因因此A和B形成“与”的关系系。（3）非门，如如图6-1c所示，假假设内源源物A对siRRNA-NOTT（A）有激激活作用用。当加加入A后，将将会抑制制Tarrgett-NOOT（A）的表表达，此此时直接接导致荧荧光蛋白白产物的的减少。将这些简单的逻辑门组合起来，就可以实现复杂的逻辑运算，如（A AND C AND E） OR（NOT（A） AND B），见图6-1d。首先确定A、B、C、E与各个siRNA之间的关系，如：加入A抑制siRNA-A，促进siRNA-NOT（A）。当A、B、C、E共同作用时，就可以根据基因排列的线性

25、关系自动进行逻辑判断。图6-1 RNAAi逻辑辑门示意意图 在在上述一一步完成成的RNNAi逻逻辑门的的基础上上，还构构建了二二层逻辑辑门。所所谓一步步完成是是指加入入的siiRNAA直接发发生作用用，降低低荧光基基因的表表达。而而二层逻逻辑门是是指首先先调控一一级蛋白白质产物物，再由由一级蛋蛋白质来来调控二二级荧光光蛋白基基因的表表达。如如图a所示，构构建了AAND运运算逻辑辑门。mmRNAA1和mRNNA2的的表达都都下降才才能最大大限度地地减少Laac抑抑制子的的表达，从而减小Lac抑制子对荧光蛋白的表达抑制。这种多层逻辑门与细胞内的蛋白、基因调控极为相似，因此在疾病诊疗方面有着广阔的应

26、用前景。图6-2 二层逻逻辑门示示意图2.5 与与DNAA自组装装立体结结构相结结合的荧荧光技术术DNA自组组装是近近期发展展迅速的的领域，也也是具有应用用前景的的领域。其其涉及编编码、杂杂交、空空间结构构设计等等多个方方面。从从自组装装结构上上分，自自组装可可分为一一维线段段结构、二二维平面面结构和和三维立立体结构构。在DNAA自组装装结构的的基础上上，结合合荧光标标记技术术，发展展了很多多精巧的的DNAA三维结结构，如如20008年Russselll PP Gooodmman等等构建的的四面体体，其边边还可以以产生荧荧光标记记的可伸伸缩茎环环22。这些些三维结结构不仅仅仅包含含有图像像、结

27、构构信息，而而且还能能随着结结构的变变化应用用于纳米米技术、药药物载体体、DNNA计算算等方面面。2008年年Yosssi Weiizmaann等等的工作作是将DNAA自组装装和荧光光技术紧紧密结合合的一个个例子223。首先，利利用DNNA分子子互补，将将两环相相接触部部分的DNAA序列设设计为互互补，杂杂交后再再经连接接酶连接接，就形形成了稳稳定的环环链结构构。通过AFFM电镜镜检测，也也能够看看到环链链结构的的存在。另外，将一个环状寡核苷酸固定在有金包被的AFM电镜感应头上，而与其有互补序列的寡核苷酸则被固定在镀有金的玻璃板上。当杂交并且被连接后，其感应力较未被连接有了显著提高，侧面说明环

28、套结构的存在。在此基础上，还设计了将DNA环分别固定在两个金微粒（1.4nm）上，然后利用内切酶进行切割分离的实验。实验结果证明，这些操作都可以在环套结构上成功实现。除了上述电电镜检测测外，YYosssi WWeizzmannn等还还利用荧荧光技术术进行了了一系列列实验。首先，如图A所示，将四甲基罗丹明标记在短寡核苷酸上，通过杂交，形成环套和多个短寡核苷酸复合物。在电镜下，可以观察到柱状荧光条带。然后，使用四甲基罗丹明标记的凝血酶，当凝血酶结合在环套的侧面时，利用AFM电镜就可以观察到荧光条状DNA，并伴有多节膨大结构。同时，还对环套结构进行了类似的双荧光探针杂交，结果发现产生了荧光共振能量转

29、移。因为只有当两个荧光基和淬灭基的距离小于5nm时，才会出现能量转移，因此，也说明环套结构是有序排列存在的。图7-1 环链结结构组成成 图图7-22荧光段段寡核苷苷酸和凝凝血酶标标记的环环链 图7-33 DDNA盒盒子盖开开闭示意意图2009年年Ebbbe SS. AAndeerseen等巧巧妙地将将DNAA荧光技技术应用用在检测测纳米装装置开启启和闭合合24。为了检检测DNNA分子子纳米盒盒子的盖盖子的开开闭，分分别在盖盖子和盒盒体上标标记了CCy3和和Cy55荧光染染料（见见图7-3）。当当加入“钥匙”DNAA链时，盒盒子盖打打开，两两个荧光光分子分分开。此此时，CCy3的的荧光信信号增加

30、加，而CCy5荧荧光信号号下降。在在该实验验中，利利用荧光光信号增增减可以以有效地地检测DDNA纳纳米装置置的空间间变化。2.6 与与DNAA变构相相结合的的荧光技技术通过DNAA分子的的不同状状态，构构建可控控的荧光光纳米装装置。随随着DNNA分子子的变构构，其荧荧光强度度也随之之变化。因因此，通通过检测测荧光强强度就可可以知道道DNAA分子的的构象变变化。1999年年，Maao等构构建了一一种基于于DNAA分子变变构的纳纳米装置置25。其应用用的原理理就是BB、Z型DNAA的相互互转换。B-DNA就是我们所熟悉的右手螺旋结构。但是，对于含有多个GC的重复序列，当离子浓度发生变化时，就会伸展

31、为左旋结构。如图8-1所示的DNA复合结构是由三条链组成的。其中，蓝色的两条链相同。在每个连接的转折处都由4的相连的T组成。在这个复合结构的中部，也就是黄色标记的序列，其中含有多个GC的重复序列。当改变离子浓度时，该区域就会伸展成为左旋结构。将荧光发射基和接收基固定在如下所示位置（圆点）。那末只有当复合结构是B-DNA时，才能通过能量转移激发出荧光。当其为Z-DNA时，由于两个基团距离加大，从而无法实现能量转移。图8-2为B、Z型DNA转换时其能量转移的变化。图8-1 DNNA复合合结构变变构示意意图 图图8-22 DNNA转换换时其能能量转移移3 近期荧荧光技术术的新发发展荧光技术发发展速度

32、度很快，在DNAA计算、信信息学、物物理学等等诸多领领域具有有很大的的应用潜潜力。下下面介绍绍几种近近年来发发展起来来的新型型荧光技技术，希希望能为为DNAA计算提提供新的的思路。（1）荧光光分子信信标信号号放大技技术；（2）与磁珠技术相结合的荧光技术（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术；（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。3.1荧光光分子信信标信号号放大技技术分子信标技技术是目目前较为为成熟的的技术，尤尤其是在在检测方方面有着着重要的的应用。但但是当检检测物很很少时，分分子信标标产生的的荧光就就不足以以被检测测，甚至至发生错错误信号号。20008年年，Gaary K GGeisss

33、等报报道了一一种基因因表达的的多色荧荧光分析析系统226。其中使使用了固固定化、探探针捕捉捉、多色色荧光标标记等多多种技术术。20005年年，Errnesst KK. LLewiis等设设计了能能同时激激发多种种荧光的的方法，使使得DNNA检测测速度以以及准确确度都大大大提高高27。2008，Jiaanweei JJeffferyy Lii等提高高了荧光光分子信信标的信信号强度度28。其原理理（如图图9-11所示）就就是先通通过普通通的分子子信标杂杂交过程程，待分分子杂交交产生荧光光信号后后，此时时，加入入特异的的缺刻DDNA酶酶，即将将因杂交交而展开开的分子子信标切切断，并并释放。从从而，再

34、再进行新新的一轮轮分子信信标杂交交释放。那那末荧光光信号就就会积累累增多。在此基础上，还建立了一种加强型荧光分子信标信号放大技术（如图9-2所示）。首先，与目标片断互补的单链DNA杂交，再使用连接酶进行连接成环。随后，利用DNA聚合酶29以环状DNA为模板，加入单引物进行PCR。在随后扩增的线性模板上，就含有多处目标片断。此时，再进行上述的荧光分子信标信号放大。就可以大大提高信号强度。图9-1 荧光信信号积累累原理 图图9-22 加强强型荧光光分子信信标信号号放大原原理3.2与磁磁珠技术术相结合合的DNNA检测测荧光技技术磁珠技术，使使得DNNA分子子的捕捉捉和释放放变为可可能。通通过DNNA

35、特异异性杂交交，可以以特异性性的获取取DNAA分子。2005年年，Huui XXu等就就将磁珠珠技术与与荧光技技术相结结合，建建立新型型的DNNA检测测系统229。首先，将将标记生生物素的的DNAA1与磁磁珠相结结合。通通过目标标DNAA3，可可以使DDNA11、2、3相互杂杂交，形形成复合合体。在在DNAA3上标标记有荧荧光集团团。通过过磁珠分分离，将将捕获的的DNAA2和目目标DNNA3洗洗脱。由由于DNNA分子子本省带带有负电电荷，于于是可以以与带有有正电荷荷的水溶溶性聚乙乙烯（被被标记有有特殊基基团）吸吸附。此此时就会会产生能能量转移移，从而而产生荧荧光，并并被检测测（如图图10所示示

36、）。图10与磁磁珠技术术相结合合的DNNA检测测荧光技技术原理理3.3与PPH值变变化相结结合的DDNA荧荧光技术术DNA的构构象会随着PHH值的变变化而改改变。利利用这一一特性，2005年，DongSheng Liu等构建了一种随PH值变化的DNA荧光装置30。整个装置是由DNA寡核苷酸阵列构成的。在每个寡核苷酸的5端标记有-SH，随后是由-CCCC-4个胞嘧啶组成的DNA序列，在3端标记有若丹明绿色荧光基团。每个DNA寡核苷酸被固定在金表面。当PH值较低时（4-9之间），有些胞嘧啶会发生质子化，从而与其他胞嘧啶产生分子间非经典配对。此时，寡核苷酸链就会形成蜷缩状结构，而不会与互补链杂交（如

37、图11-1所示）。在这种状态下，荧光集团非常靠近金表面（约1nm），此时就不能被激发光激发。随着PH值的增大，胞嘧啶质子化程度降低，其分子间非经典配对也随之降低。若加入互补链，在金表面，展开的寡核苷酸会与互补链杂交，使得寡核苷酸3端的荧光集团远离金表面（约8nm）。当有激发光激发时，就会产生绿色荧光，实验还证实这种荧光的变化是可逆的。通过控制PH值，可以有效地进行荧光变化。图11-11 原理理图图11-22 随着PHH值荧光光可逆地地进行变变化。a：PH值4.55；b：PH值9.00；：PH值4.55；：PH值4.55；3.4 与与miRRNAss检测相结结合的荧荧光技术术 mmiRNNAs在

38、在真核生生物的调调控中发发挥着重重要的作作用。但但是miiRNAAs的含含量很低低，检测测起来比比较困难难。结合合DNAA寡核苷苷酸微列列阵技术术、荧光光技术、酶酶切、酶酶联技术术，20004年年Petter T NNelsson等等发明了了一种称称为RAAKE的的检测mmiRNNAs的的方法331。首先建建立寡核核苷酸微微列阵。每每个寡核核苷酸由由三部分分组成：支架序序列、数数个胸腺腺嘧啶、特特异性mmiRNNAs的的互补序序列。将将寡核苷苷酸链55端共共价连在在芯片玻玻璃表面面。其次次，当mmiRNNAs特特异性杂杂交在寡寡核苷酸酸上时，用用核酸外外切酶处理，将将没有特特异性杂杂交上mmi

39、RNNAs的的寡核苷苷酸链降解。此此时保留留下来的的寡核苷苷酸上都都杂交有有miRRNAss。与此同同时，使使用DNNA聚合合酶Kllenoow，以以miRRNAss为引物物，以保留下下来的寡寡核苷酸酸链为模板板，再加加入共价价连接有有生物素素的dAATP进进行扩增增。最后后，加入入共价连连接有荧荧光基团团的链合合霉素，使使其与连连接有生生物素的的DNAA链结合合。通过过激发荧荧光，保保留下来来的、并并被扩增增了的寡寡核苷酸酸区域就就会发出出荧光。其荧光量的多少，还能显示该miRNAs量的多少。图12 RRAKEE原理示示意图4 展望在生物技术术高速发发展的今今天，DDNA计计算的研研究也是是

40、日新月月异。近近年来，在在高水平平科学研研究刊物物上，发发表了大大量DNNA计算算方面的的研究成成果。DDNA计计算一直直是世界界科研领域域的研究究重点和和热点。DNAA计算发发展至今今，已经经从开始始的实验验阶段逐逐渐转入入实用阶阶段；从从单一型型技术逐逐渐发展展为多元元化技术术；从简简单的结结构逐渐渐扩增为为复杂结结构。荧荧光技术术作为一一种生物物技术，其其发展较较早，且且应用广广泛。因因其体积积小，便便于标记记，反应应速度快快，变化化灵敏，所所以在核核酸标记记和检测测方面有有着得天天独厚的的优势。对于DNAA计算这这种精细细化、定定量化、复复杂化的的发展，荧荧光技术术的种种种特性都都可以

41、满满足并适适用于DDNA计计算的发发展。比比如近两两年，关于DDNA链链置换荧荧光技术术的研究究，这种种链置换换过程都都属于单单分子间间的变化化，如果果使用常常规生物物实验手手段根本本无法实实现。而而荧光技技术的单单个分子子标记，荧光激发和湮灭性质，及其实时超高灵敏性检测都表明其在DNA计算中的天然优势。因此，荧光技术的进步必然推动DNA计算的发展。同时，荧光技术在DNA计算的应用也拓宽了其自身应用领域。这种跨学科、跨领域的融合贯通是推动整个科学前进的原动力。一方面，应该关注荧光技术与其他生物技术（如基因芯片技术、磁珠技术等）最新的发展和联系；另一方面，必须深刻的认识和了解计算科学所亟需解决的

42、重要问题。只有充分的将两个方面有机地结合，通过提出创造性想法，才能将DNA计算转变为实用、稳定的计算手段；才能发挥DNA计算天然的优势.参考文献许进等.DDNA计计算机原原理、进进展及难难点()分子生生物计算算中的数数据结构构与特性性.计算机机学报，2007，30（6）：869-880Hao YYan. Nuucleeic Aciid NNanootecchnoologgy. Scieencee,3006,220488-20049Jonatthann Baath, Anndreew JJ. TTurbberffielld. DNAA naanommachhinees. natturee naa

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