HIV-1病毒载量测定及质量保证指南

1、HIV-1 HIV-1 病毒载量测定及质量保证指南 PAGE PAGE 9 病毒载量测定及质量保证指南（2013 版）GuielineViralTestinganQualityAssurance中国疾病预防控制中心2013 1 月前言 病毒载量检测仪，覆盖疾控、医院、检疫病13 病毒载量检和质量控制， 规矩实验室操作， 以保证检 测结果的准确性和可靠性。病毒载量测定及质量保证指南（试行， ）病毒载量能力验证工作的实验室从29 家，占已开展工作实验室的百分之九况， 考虑各种试剂的 检测要求， 接合专家意见和一线实验室工作人员的经验与需求， 关于本指南进行了 适当修改、调整和补充，主要修改内容囊括

2、：（1）增加人员要求章节；（2）修改常用 病毒载量检测方法 3）修改“ 病毒载量检测能力验证（ 4）补常见问题分析和处理等内容。修订后的指南共分八章，囊括：总则，人员要求，实验室环境与设 （实验室生物安全，以及四个附表。本指南在修改进程中， 接纳了国内专家、 同行的意见和建议， 经过多次修改 编写成指南 （2013）版。本指南由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控 制中心艾滋病参比实验室组织有关专家撰写，由中国疾病预防控制中心批准执 行，并且在 HIV-1 病毒载量检测实验室网络内发布实施。由于国内各实验室条件不同， 不能采纳一切实验室的建议， 因此本指南主要 提出一些原则上的参考建议， 其中

3、定有不妥之处， 希望广大同仁提出意见， 以便 不断完备。 年公布的指南（试行）的基础上修订，在此关于编写试行 版进程中给予帮助的国际组织和专家表示感谢。关于本次修订进程中提出建议的全国 HIV-1 病毒载量检测实验室基层工作人员表示衷心的感谢。 本指南的解释权属于中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。 本指南编写主持人：蒋岩本指南编写人员： 潘品良 蒋岩 李敬云 钟平 尚红 李太生 李繁 本指南审核咨询专家及技术人员： 邵一鸣 汪宁 王佑春 郭志宏 肖瑶 邱茂 锋邢文革 姚均 朱红 秦光明 徐建青 本指南编写联系人：潘品良本指南适用于全国 HIV-1 病毒载量检测实验室 本指南编写单位：

4、中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 本指南自发布之日实施，同时终止 2008 年公布的 HIV-1 病毒载量测定及质 量保证指南（试行）。 目录第一章 总则第二章 人员要求第三章 实验室环境与设施第六章 室内质量控制（1 常见问题分析和处理附表2病毒载量检测样本送检及接受单附表3病毒载量检测能力验证样本接受专用附表4病毒载量检测报告单参考文献缩略语第一章 总 则意义是艾滋病防治工作HIV 感染的扶助诊断， 囊括 窗口期、病程晚期、婴儿感染、疑难样本等的诊断；也可用于血液筛查。为了保 证检测结果的准确性和可靠性， 必需关于开展目的指导 HIV-1 病毒载量检测工作，规矩实验室质量控制与管

5、理。适用范围适用于我国开展 HIV-1 病毒载量检测工作的一切实验室。第二章 人员要求HIV-1 病毒载量检测人员分为试验人、复核人、签发人。培训 实验室在使用新方法前， 须关于技术人员进行上岗培训， HIV检测相关基础知识 试验人进行 病毒载量检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格复核人、签发人 应具备关于检测进程进行分析、 解决问题的能力。复核人负责关于原始数据查阅、 结果核关于，签发人核实结果正确后关于外签发报告。第三章 实验室环境与设施病毒载量检测质量的重要方面。实验室环境HIV-1 病毒载量实验室应契合分子生物学实验室基本要求，囊括试剂准备 区、样本处理区、扩增产物分析区。 实验

6、室设置总体原则为各区独力、控制风向、 因地制宜、方便工作。具体要求：各区必需是相互独力的，有条件各区内可诀别设置缓冲间，以保证不同 区之间完全分隔开。各区的仪器设备与各种物品必需为专用，避免交叉污染。试剂准备区和样本处理区内须保持低度正压（或常压）流 向始终由室内向外，以避免扩增污染物进入此区域。扩增产物分析区内须保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向 室可安装排 风扇或其他排风装置。扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。工理 区，然后到扩增产物分析区。实验室设施病毒载量检测实验室设备分布示意图提供根据不同检 测方法作相应变化。样本处理区： 离心机（离心管） 以下水浴箱：误差范围小于1

7、套、）带滤芯的一次性吸头（酶离心管（和酶）计时器旋涡振荡器：震动频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套HIV-1 病毒载量检测实验室设备分布示意图病毒载量仪生物安全柜病毒载量仪加样器漩涡振荡器台荡器扩增产物分析区试剂准备区：超净工作台（或密闭工作台）样本处理区试剂准备区冰箱2-8冰箱2-8冰箱冰箱2-8-70冰箱- 201套、）（ 离心管） 计时器旋涡振荡器，震动频率可调 带滤芯的一次性吸头（无 、 酶 离心管（酶）及相应试管架一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套扩增产物分析区：HIV-1 病毒载量检测仪1 套、）帽、口罩、无粉手套和鞋套 带滤芯的一次性吸头（无 、 酶）HIV-1

8、HIV-1 病毒载量测定及质量保证指南 PAGE PAGE 25第四章 样本的采集、处理、保存和运输病毒载量检测方 法关于样本性质的，并且保证生物安全。因此需依照所使用检测方法的要1 样本的采集采样器材：一次性抗凝真空采血管、持针器、蝶形针等。抗凝剂：通常采用 E（乙二胺四乙酸）或 （枸橼酸钠），契合 不同检测方法关于样本的要求。样本标识：在采血管上贴唯一性样本编号。样本采集量：通常采集全血采集的样本量应与定量采血的 刻度要求一致，避免血液凝固或稀释。10 与抗 凝剂充分混匀。 病毒载量检测样本送检及接受单（2）的备注栏 内需注明采集关于象的基本信息和流行病学资料、抗病毒药物使用情况、最近一

9、次的实验室病毒载量检测结果。样本的处理要求在采血后6 小时内离心样本，室温下使用离心力为离心10分钟后，吸出血浆,分装到无菌的聚烯螺口冻存管 中，并且注明分装时间，冻存管应提前贴上耐冻的样本编号标签。血浆样本不能灭活。做好样本处理记录，囊括冰箱温度变化、样本存取。样本的保存4 3 以下。不能使用自动除霜冰箱。3 次。监控并且记录保存温度以及样本状态的变化防止样本变质、泄漏及污染。样本的运输 根据可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）本运输管理规定的要求运输，并且严格控制运输的冷冻状态，避免样本融化。样本的发送和接受发送样本时,需详细填写样本病毒载量检测样本送检及单（附表 。 （附表2）核关于

10、样本数量，检查样本状况。样本管破损造成样本溢出、 出现鲜明溶血、 凝血的样本， 次。第五章 常用检测方法简介 病毒载量检测根据方法的原理不同，分为不同系列仪器，目前常用的HIV病毒载量的测定方法有：核酸序列依赖性扩增技术代表产品为实时荧光技术仪；分枝信号放大系统( )技术，代表产 品为 40分析仪；实时荧光定量 扩增技术()，囊括检测系统、 检测51 ) 术最早产品为定量测定方法，已经被EQ 新一代实时分子信标定量扩增所取代。所采用的 技术是一种温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶 多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制进程。sEQ接合 技术、 核酸提纯技术与分子信标

11、探针技术( )检测血浆中的HIV水平。这种接合方法用实时扩增分析( )，提高关于诊断质量的要求。此方法可分为三个步骤：核酸提取、扩增和等温检测。 的检测是利用靶特异的分子信标进行，分子信标的寡核苷酸片段包含一段可特异接合靶的序列。当互补链不存在时，分子信标维持内部发夹结构， 使猝灭基 团处于非常接近荧光素的位置， 荧光信号被猝灭。当分子信标与互补靶序列接合， 发夹打开释放荧光信号，报告 的扩增子， 各使用不同荧光染料 ( 野毒株使用 ，内标物使 用 -)从而实现靶序列和内标物 两个扩增进程的各自跟踪。荧光信号 的含量。分枝 ()技术信号放大系统， 为一个人工合成的分枝 ，分枝 的分枝可接合多个

12、酶标记物， 方法定量系统中 没有内标记物， 每次实验设置一系列外部标记， 经过实验样本反映强度与外部标 记样本强度的比较确定待检样本的病毒拷贝数。检测通常囊括以下步骤： （1）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核苷酸靶探针的裂解液加到微孔中； （孵育，释放病毒核酸降解酶或使变性,然后靶探针接合到靶或并且固定在固相板上；（）冷却 洗板；（）加信号放大探针 到各孔内；（）孵育，使杂交到靶探针的相应部位；（6）冷却洗板；（7）加标记探针到各孔内；（8）孵育，使酶标记的探针杂交到上；（9）冷却洗板；（10）（ 表示。产生的光强直接与样本一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。病毒载量检测仪较 作转

13、 变为自动化，减少污染，更便于操作节省实验时间。实时（）荧光定量扩增反映体系中加入荧光基团，利用荧进程，最后经过标准曲线关于未知模板进行定量值） 的起始拷贝数。实时荧光定量扩增的实验检测进程可分为：样本制备,抽提PCR检测的原理鉴于荧光信号增长曲线与循环数相 关。反映，病毒 将 ，然后经过 聚合酶关于特定片段进行扩增。 （）扩增产物的检测，鉴于检测阈值的设定， 当病 毒载量高时， 低循环数即能检测到荧光信号， 当病毒载量低时， 高循环数时才能 检测到荧光。 循环数与样本病毒载量成线性关系。 利用标准品制作循环数与病毒 载量的标准曲线就能关于样本病毒载量进行定量检测。检测系统、检测仪和国内产品凯

14、杰、达安以及正制的定量检测试剂均属于该技术。检测系统是全自动化的实时荧光定量病毒载量平台,具有样本进结果出的特点。此方法的检测进程为：装待测样本、放试剂和耗材、 核酸提取、 PCR反。荧光探53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团 分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩产物形成完全同步，从而实现定量。被同时扩( 仪器上，每个扩增循环中存在 系浓度关于数成比例。检测仪。不同方法检测结果间相互关系病毒载量的检测单位有拷贝数和国际单位，且同一样本不 同方法的病毒载量检测结果不同， 另外，不同方法间检测结果并且无定的转换关 系，与病毒亚型、 试剂不同版本有关， 因此评估同一病

15、人的治疗效果需用同一种 方法检测，并且且考虑试剂版本的更新情况。第六章 室内质量控制内部质量控制是在良好实验室整体环境支持下， 从样本接受到发出报告：（ 人员；（2）实验室分区和环境；（3）（ 4）检测进程（试剂、操作进程、质控品使用） 数据报告。人员HIV-1 病毒载量检测人员分为试验人、复核人、签发人。一切相关试验人员需经操作培训， 合格， 持证上岗。复核人、签发人应具备关于检测进程进行分析、解决问题的能力。实验室分区和环境实验室分区的功能HIV-1 病毒载量检测实验室原则上应分为三个独力工作区： 试剂准备区、 样 品处理区、 扩增产物分析区， 并且设在不同房间。 不同检测方法的分区功能和

16、要求 可有所不同。试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存；样本处理区：样本登记、分装，核酸提取、保存和加样；扩增产物分析区：产物扩增的测定、结果分析、登记及报告。 增产 物分析区，不能逆向流动。实验室的设置及扶助设备的具体要求参见第三章。实验室环境的要求实验室有足够的空间；采光好，应避免阳光直射设备；室内相关于湿度控制在 ； 病毒载量检测仪应配备稳压电源；室内保持干净整洁，无灰尘；次氯酸钠即时处理操作台面。仪器设备质控一 次。次。离心机可以委托计量部门或公司校准，每年一次。冰箱、水浴箱用校准合格的温度计测量温度，每次做好记录。检测进程质控试剂质控使用经国家食品药品监督管理局注册的试剂。一切试剂

17、盒须严格按要求条件保存。试剂盒拆封时， 要记录拆封时间， 效期内 使用。实验用水：要求使用无 酶的去离子水。操作进程质控依照试剂盒要求与实验室的条件即时更新标准操作程序（ ），严 格执行，不得擅自修改。质控品的使用 拷贝/ 毫升质控品）， 如果试剂盒没有阴性质控品，需加一个阴性质控品。外部质控品的制备、定值及使用制备关于用于制备质控品的大样本血浆样本，要求用 E抗凝剂抗凝，新鲜抗凝血离心分离，得到透亮血浆。然后用孔径为微米的滤膜过滤除菌充分混 匀。按各自方法关于样本量的需求，用无菌冻存管定量分装，标记，封口，冻存于以下非自动除霜冰箱内，避免反复冻融。按实际使用量的要求配制足够量 外部质控品（推

18、荐每次配置量可使用两年） 。定值5 IU 值换算成 0 值，计算其算术平均值（ ）和标准偏差（ ）。质控图的绘制和使用根据测得值，在坐标图上画出平均值、3S 线图，作质控图使用。每次检测都应带一个外部关于照，将得到的外部质控品 标在上述质控图上。每次质控品测得值在平均值内方为有效。使用新批次的外部关于照质控品时，必需重新绘制质控图。质控品不宜使用稀释方法治备。数据分析、结果报告在试剂盒及外部质控品结果满足要求的前提下，关于样本进行分析。外部质控品不合格，样本需要重新检测。结果超过检测上限的样本应稀释以后重新检测。复核人关于检测结果进行仔细复核并且关于结果提出结论、签字。签发人关于结果的结论进行

19、审核、分析、总结、签字。按不同方法的要求，以拷贝/毫升或国际单位/毫升为单位报告的 病毒载量值。（HIV-1 病毒载量检测的外部质量控制可以经过参加外部质量评判， 提高实验 结果的可比性， 发现系统误差， 改进实验室工作， 提高检测质量。HIV-1 病毒载 量检测实验室须参加艾滋病 / 丙肝参比实验室或有资质的国内外机构组织的 HIV-1 病毒载量检测能力验证来实施外部质量控制。PT 组织艾滋病/病毒载量检测能力验证（病毒载量检测能力验证的计划并且组织实施。PT项目，在规则HIV-1病毒载量检测报告单（4），/ 丙肝参比实验室。鼓励有条件的实验室参加有资质的国内外机构组织的 PT 活动。PT

20、实施PT5 可以 根据实验室的考核目的制备考核盘。PT 2 次。PTPT 病毒载量检测能力验证样本接受专用单附表3）， 3 天内传回艾滋病/丙肝参比实验室。如发现考核样本缺 失、量不足、空管等情况，即时书面回报，艾滋病/丙肝参比实验室负责寄或更换。收到样本后应及时检测或在 度以下保存。PT常 规检测人员进行。PTPT的实验室必需在规则的时间内， / 丙肝参比实验室，艾滋病/丙肝参比实验室将负责结 果录入和处理。有任何原因不能按时上报者，需有单位盖章的书面申请。评分原则将参与实验室反馈结果换算成关于数值（考核 品的的一切实验室结果进行统计，算出平均值（ ）和标准偏差（ S）。成绩判定： 根据每个

21、参与考核实验室一年两次一切考核品结果进行综合评分（每一个考核品的评判标准依照与条款），判定标准为： 优秀：一切考核品没有问题；良好：有一个考核品满足中的条款；合格：两个考核品满足中的条款 不合格：至少有三考核品满足中的条款或至少一个考核品出现中的条款。 内；考核结果报告没即时上报；没按要求上报原始记录。样本结果超过样本结果；假阳性；假性； 无效结果。评估结果反馈：艾滋病/丙肝参比实验室根据各实验室的两次考核结 果，即时反馈每次评估结果。每年反馈最后的评估结果，并且发证书。报怨和申诉： 参评实验室如关于评估结果或其它方面存有异议，可以10/后予以 答复。现场督导：根据考核情况的需要，艾滋病/丙肝

22、参比实验室组成术 专家组关于不合格实验室进行现场检查。 检查内容囊括： 实验原始数据、实验室布 局、仪器运行状况、扶助设备校准状况、实验耗材质量、样本保存、试剂盒使用 状态、人员培训状况、 质量保证和质量控制等。 给实验室反馈督导报告， 现场实 验室按相关建议作出整顿。第八章 实验室生物安全相关依据病原微生物实验室生物安全管理条例 、实验室生物安全通用要求 、可 感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规则 、人间传染 的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法和全国艾 滋病检测技术规矩 。安全细则室内进食、饮水和吸烟以及使用化妆品。一切样本囊括试剂盒中的人源性成份（

23、如阴、阳性关于照）都应在生物安全柜内进行处理。样本应盛装在有螺旋盖的离心管中， 以防样本溅出或产生交叉污毒剂处理 污染区及器材；接触过标本的耗材应置有专用消毒剂的容器，与一次性物品一 起在丢弃前进行高压灭菌处理。避免试剂盒中各种有毒有害化学成分（硫氰酸胍）关于人体或环境可能造成的危害。生物安全培训掌握生物安全保证的原则、措施。每个人的安全教育均应记录在实验室和人事档案中。检测生物安全培训 及 HIV-1 病毒载量检测培训。督。一切实验室意外事件均应进行记录和报告。一切人员要保护自身和环境的安全。参照实验室安全指南和标准操作程序的有关规则执行具体操作。职业暴露处理实验室应建立完备的艾滋病职业暴露

24、后的预防机制。发生职业暴露后，首先进行应急处理，然后根据暴露级别和暴露源时，尽早开始服用抗病毒药物。按规则进行职业暴露登记、检测和报告，注意做好保密工作。1 常见问题分析一） Easy Q问题（出现错误代码）处理方法错误代码 1：未检测到信标 严格按标准操作步骤执行 （如样本裂 解、酶溶解要充分）2：内标数据与野生型数据不符错误代码3：曲线中断使用稳压电压a、标本中有严重的溶血、脂血和纤维蛋白或一些未知的克制因子 , 浑 分钟。、充分裂解样本。c、加硅胶后， e、清洗进程中要洗干净裂解液或洗 液，管壁上有残留将核酸和硅胶分离。（核酸又被硅胶吸附） h、转移核酸时避免吸入硅胶。错误代码 4：无扩

25、增i、充分溶解引物，立即振荡溶解j、充分溶解酶。放置时间要大于15 分钟。复溶时需在室温下进行。、用准确的微量加样器加入足量引物。l、排除排管底部的气泡，排管放到孵育器上时需压紧。、充分振荡排管，完全混匀反映体系液体。n、密封保存排管、离心管等耗材。o、控制环境中的克制物污染。 p、错误代码5：弱扩增反映排管。曲线平缓， 操作时温度控制稳定及混 合充分错误代码6：计算错误检查电脑软件错误代码7：异常扩增正确加入核酸，保持电压稳定，严格控制引入克制物。错误代码8：延迟时间过短加入酶后即时进行扩增，操作熟练。错误代码9：弱扩增常见错误，详见代码 4。应注意操作细节避免错误发生。错误代码未检测到内标

26、加入内标， 减少标本量或者稀释样本错误代码 11：信息不全错误代码 11：信息不全再进行检测。4 9 避 免错误发生。导出结果，曲线截图，公司工程师解决。问题处理方法注射器含有气泡加适量的溶液在空瓶里；管路都在各自的瓶内液面下。分析仪底部的加热托盘上有液体管路有堵塞或细菌滋生分析仪不能从孔内吸取足够的液体值低值高变异系数 (CV)高标准曲线平坦或不正常强或弱关于照定量高强或弱关于照定量低检查管路连接。每次实验后清洗并且晾干洗液瓶和水瓶， 倒空废瓶； 每周清洗洗液瓶,水瓶和废液瓶，管路系检查废液管连接头确定按产品要求储存、配制试剂；环境温度在 剂来 自同一批次；每周清洗进程中在管道和试剂瓶中没

27、有残留。确定全使用干净的一次性无菌实验材料；使用防气溶胶的加样枪头；残留的底物没有倒回原瓶； 用乙醇定期擦洗微量加样器；盛洗液的试剂瓶内有足 够量的洗液； 检查分液、吸液操作；每周进行保养；分析仓门关闭严实；检查背景确定微量加样器经校准；使用防气溶胶的枪头；枪头紧密套在加样器上；加试剂时枪头位置在孔的中部；样本凝块或残渣没有被吸取；样本加的位置与样本I 和规则的位置一致；样本按产品说明收 集,处理和储存；只使用干净的一次性无实验材 料；检查分液吸液操作；盛洗液的试剂瓶内已装有 足够量的洗液；每种试剂在实验开始前被轻轻混匀； 每种试剂预热充分,以防有沉淀封闭垫组装正确； 孔内样液没有溅洒；分析仓

28、门关闭严实；检查 背景。加标准时板的缺口在左边确定各孔仔细加样 ,未触及邻孔；使用无菌枪头； 封闭垫组装无误；加样器定期校准；使用气溶胶 的枪头；标准和关于照加样位置正确；按品说明要 求储存,配制。确定试剂盒在运输和到货后储存在正确的温度；使用无菌枪头；没有吸取气泡；封闭垫组装无误；加样器经校准；小心处理测试板 , 防止溅洒；标准打液不均匀排液残余量过多 WA背景光路值大于或等于 0.05 IRL实验进程中一孔或者 几个孔出现 或者 报警，但仪的孔没有实验结果。 仪器底部洗站周围出 现水迹或者有鲜明漏 水照加样位置正确；按产品说明要求储存 ,配制样 品,标准,关于照在吸取前至少震荡5 秒。检查抽洗轴头是否堵塞，如果有堵塞，卸下后用注射器疏通。检查用于进行背景检查的白色间隔反映孔是否被污，检查光路读数头是否有破损漏光现象检查实验用水和次氯酸钠是否达标， 水是否有污染， 管路是否有堵塞或者漏气现象，反复清洗管路。检 查抽洗轴头是否堵塞