酵母双杂交文库筛选与蛋白互作验证服务

1、酵母双杂交技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用的一种蛋白组学方法，是基于对真核生物的 转录因子调控转录起始过程的认识而发明的技术。其基本原理是利用真核生物酵母的转录激 活因子Gal4可分为结构上分开并且功能独立的两个结构域：N端1-147aaDNA结合结构域(DNAbindingdomain,BD)和 C 端 768-881aa 转录激活结构域(Activation Domain,AD)，Gal4 的N端和C端可以分开构建表达质粒，将N端和诱饵蛋白(研究的目标蛋白A)融合表达，C端和细胞cDNA或者猎物蛋白X融合表达，如果cDNA编码的蛋白x能和A互相作用，就 能把Gal4的C端和N端联系在一起，

2、形成转录因子，激活UAS下游的基因表达，原理如图 1所示。图 1 酵母双杂交技术原理图(引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3&Libraries User Manual).公司选用的是美国Clontech公司(现为Takara公司收购)的MatchMaker系列酵母 双杂交系统，所用的AH109, Y187酵母菌株，是通过基因工程的方法突变了内源Gal4转录 因子的工程菌株，并在GAL4 UASs和启动子的下游构建了 3个报道基因-ADE2，HIS3，MEL1(或LacZ)，因此可以通过营养缺陷和显色报告基因的表达来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用

3、。菌株信息如图2所示。TABLE 1. MATCHMAKER VEAST STRAIN GENOTYPESStMtnGenoiype3F?eference$AHW9b0 -皿心$ 10 ura3-&2 $3-200, gai4AtLYS2: GALJ-GAL 1T.v-HfS3tGALg-GAL2taADEZURA3 ： MEL -MEL 板腿已 MEL 1Our unpublished observations107ura3-52r his3-200r de2-1Q1, trpl-901,URA3:区 IgGHL 临盘球岫 7Harper er M, 1993AH149 Conskct$ME

4、LI IMS弓I ll MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System J&Libianes U;er Manual(clontedi)曲LI TATAGA11 UASGAL2 瞄 GALHATA MELI UASMEM TATAJU EllMELI TATA所用表达载体信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyb-rid Sy&tenn 3&Ub旧AH149 Conskct$MELI IMS弓I ll MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System J&Libianes U;er Manual(clontedi)曲LI TATAGA11

5、 UASGAL2 瞄 GALHATA MELI UASMEM TATAJU EllMELI TATA所用表达载体信息如下引自 MATCHMAKER GAL4 Two-Hyb-rid Sy&tenn 3&Ub旧ri晤山审 Mm#洲般四策h)H海 III*SVVtJLS pGADTZ wmd 8.0 hb HA 书 piiopoi巡Hindll 0伽IIImil 火，以Hi冏II|HIIpGBKn 5 7 3 kbpvc 0fi 酵母双杂交技术优点：高效:转化方法简单，转化效率高，便于操作。灵敏可检测蛋白质之间的微弱作用。真 实:酵母细胞是真核细胞，融合蛋白之间的相互作用是在真核细胞核内进行的,蛋

6、白质经过翻 译后的修饰，多数可以保持蛋白质的天然空间构象和折叠状态接近其真实的生理状态，一定 程度上可代表其在细胞内真实情况。简捷:只需要构建诱饵表达载体，可以省略蛋白质抽提 纯化或抗体制备的繁琐步骤。酵母双杂交服务内容介绍：酵母双杂交cDNA文库构建：服务内容：总RNA提取、纯化一mRNA分离一cDNA制备一cDNA连接AD载体一连接产物转化大肠杆菌-cDNA文库效价测定一cDNA文库扩增一cDNA文库扩增后的质粒DNA纯化一纯化后cDNA 文库质量的鉴定（如PCR和酶切鉴定等方法）等合作方式：为客户构建指定的酵母双杂交基因文库。由客户提供cDNA或组织、细胞等。服务完成时提供详细的实验报告

7、以及文库酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选相互作用蛋白：服务内容：l诱饵质粒的构建及自激活作用和蛋白毒性检测l组织cDNA文库的构建（或客户提供）l酵母接合效率的计算及接合后初步阳性克隆筛选的统计l阳性克隆文库质粒的提取，转化酵母后自激活作用检测l酵母双杂交筛选结果的质粒回转验证结果l阳性克隆文库质粒的提取，转化细菌，测序及登陆NCBI等网站进行序列比对，公布最 终筛选结果合作方式：为客户对指定的基因文库进行酵母双杂交筛选，筛选完成后向客户提供详细的筛选报告和阳 性克隆实物，客户需要提供诱饵基因信息。酵母双杂交技术检测指定蛋白对之间的相互作用：技术服务内容：l诱饵蛋白表达载体与猎物蛋白表达载体

8、的构建l表达载体转化酵母的验证及自激活活性，毒性检测l诱饵蛋白质粒与猎物蛋白质粒共转化酵母的验证以及相互作用的检测报告l 无相互作用时诱饵和猎物蛋白的表达情况的Western blotting检测合作方式：为客户对指定的2个或多个蛋白之间进行酵母双杂交实验，验证其相互作用。由客户提供基 因克隆，抗体，或从公司购买抗体。实验完成后向客户提供详细的实验报告和相互作用阳性 的酵母共转化菌株。部分实验案例图示ioaob|i，海p 50Ob图2. 4个C盛片段的PCR图诸图3一 4个。或US1片段诱饵载体 的酶切鉴定图诸丑-b.p皿即5000 皿201075-u oooo o 0505Q 0752图g

9、16种共转化ORUSl诱饵载怵与。站适2 J猎物载体的酵母AH109菌落的PCR验证5656Os02g5024096.89%67Os06g4064099.76%65Os02g4652022Os05g40180putative, expressed45Os04g5424038Os05g11320克隆编号相似序列登录号蛋白功能描述相似百分比glutamine synthetase, catalytic domain containing protein,expressedfructose-bisphospatealdolaseisozyme, putative, expressedhydrolase, putative,expressed 95.22% serine/threonine-protein kinase stt7, chloroplast precursor,77.27%wou