艾滋病实验室检测技术及职业暴露教材课件

1、 艾滋病检测实验室检测技术及职业暴露1 艾滋病检测实验室检测技术及职业暴露1内容1、我省艾滋病检测实验室建设及目标2、艾滋病检测实验室检测技术3、职业暴露及防护2内容1、我省艾滋病检测实验室建设及目标2我省艾滋病检测实验室建设情况 目前我省艾滋病检测实验室已达630个 1个艾滋病确证中心实验室（省疾控中心） 6个艾滋病确证实验室（济南、青岛、淄博、烟台、临沂疾控中心、山东出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心） 18个艾滋病筛查中心实验室（含5个艾滋病确证实验室） 610个艾滋病筛查实验室。 目前已验收16个待验收艾滋病筛查实验室2个、确证实验室1个3我省艾滋病检测实验室建设情况 目前我省艾滋病

2、检测实验室已达我省艾滋病确证实验室建设情况1995年2月6日，山东省卫生防疫站艾滋病确证实验室通过卫生部验收。2005年2月18日，青岛市疾控中心艾滋病确证实验室通过验收。2009年4月8日济南、淄博、烟台市疾控中心艾滋病确证实验室通过验收。2013年4月1日临沂疾控中心艾滋病确证实验室通过验收。4我省艾滋病确证实验室建设情况1995年2月6日，山东省卫生防我省艾滋病检测实验室检测能力省疾控中心：艾滋病抗体的筛查、确证；CD4淋巴细胞；病毒载量；耐药；新发感染；婴幼儿早期诊断、HBV、HCV、TP。抗体确证：济南、青岛、淄博、烟台、临沂市CDC（待建潍坊市CDC ）。CD4淋巴细胞：济南、青岛

3、、烟台、菏泽、泰安、济宁、临沂、潍坊市CDC 艾滋病抗体筛查：610个实验室。5我省艾滋病检测实验室检测能力省疾控中心：艾滋病抗体的筛查、省CDC实验室检测能力2013年8月23日顺利通过资质认定、食品检验机构资质认定、实验室认可“三合一”现场评审.实验室认可项目： 27类1313项实验室资质认定（计量认证）项目：22类740项食品检验机构资质认定项目： 5类573项艾防所通过项目：艾滋病抗体筛查、确证 CD4T淋巴细胞检测 病毒载量 乙肝、丙肝确证6省CDC实验室检测能力2013年8月23日顺利通过资质认定历年筛查实验室考核情况7历年筛查实验室考核情况7目标1：确证实验室目前全部建在疾控系统

4、目标：2015年底，17市疾控全部建立，鼓励医疗卫生系统建立艾滋病确证实验室。山东省卫生厅关于进一步加强全省艾滋病检测工作的通知 鲁卫疾控字201328号（2013年5月9日下发）8目标1：确证实验室目前全部建在疾控系统8目标2：艾滋病筛查实验室目标：2013年底，皮肤病性病防治机构、妇幼保健机构、采供血机构（单采浆站）及各类二级以上（含二级）医疗机构要建立艾滋病筛查实验室。山东省卫生厅关于进一步加强全省艾滋病检测工作的通知 鲁卫疾控字201328号（2013年5月9日下发）9目标2：艾滋病筛查实验室目标：2013年底，皮肤病性病防治机目标3：艾滋病检测点1、目前全省尚未建立2、目标：2015

5、年底，所有的乡镇卫生院、社区卫生服务中心和一级医疗机构都建立艾滋病检测点，鼓励具备条件的乡镇卫生院、社区卫生服务中心和一级医疗机构建立艾滋病筛查实验室。山东省卫生厅关于进一步加强全省艾滋病检测工作的通知 鲁卫疾控字201328号（2013年5月9日下发）10目标3：艾滋病检测点1、目前全省尚未建立10目标4：扩大检测1、肾透析人群2、医院侵入性诊疗人群3、计划生育门诊就诊人群4、单位体检人群5、无偿献血人群 五类人群全部进行丙肝检测山东省卫生厅关于印发山东省艾滋病扩大检测工作活动方案的通知 鲁卫疾控字201329号（2013年5月9日下发）11目标4：扩大检测1、肾透析人群11二、艾滋病实验室

6、检测技术（一）HIV (ELISA、金标、PA、化学发光、WB)（二）TP (ELISA、 TPPA 、 TRUST)（三）HCV (ELISA、RIBA)（四）BED （ELISA、亲和力)12二、艾滋病实验室检测技术（一）HIV (ELISA、 2009 2006艾滋病检测工作有关的技术规范和指南2006200820112011 2008 200413 2009 2006艾滋病检测工作有关的ELISA 14ELISA 14OD值S/CO值 双波长的优点CUTOFF值OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度 。S/CO=OD/CUTOFF使用双波长的优

7、点可以消除 反应板条上的划痕手印的干扰。仔细阅读和理解说明书,严格按照说明书要求操作15OD值仔细阅读和理解说明书,严格按照说明书要求操作15常见问题原因分析及解决办法(1)试剂1.观察外包装，内主份有无漏液，注意效期等。2.仔细阅读说明书，严格按照试剂说明书进行操作。3.操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟，保证酶等液体的初始反应温度及活性剂的溶解。 16常见问题原因分析及解决办法(1)试剂16(2)加样过程应注意的问题 1.血清或血浆标本分离不好即进行加样。 2. 漏加样品或加样量不足的 3.加液器的校正 4.加样时间过长 5.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长 6.

8、洗板机不足，不能及时洗板 17(2)加样过程应注意的问题 1.血清或血(3)孵育过程中出现的问题1.温箱孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合，难以清洗彻底。3.孵育时温度不符合说明书的规定范围。1.按规定加盖封板膜。 2.按说明步骤严格控制孵育时间。3. 严格控制温育仪器（水箱、温箱、全自动酶免）的温度，建议在仪器内放置测量工具（全自动酶免除外）。（解决办法）18(3)孵育过程中出现的问题1.温箱孵育时未贴封片或加盖，使标(4)洗板过程中易出现的问题1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切不可随意洗板。2.采用洗板机洗

9、板时，洗液注入孔中量不足，导致洗板不彻底，造成本底高。3.由于血液中纤维原蛋白，造成洗板针堵塞，抽吸不完全，造成洗板不畅，导致洗板效果差，直接影响本底。 4.反应板过多，不能保证及时洗板，造成洗板等待时间过长，影响结果。 5.洗板前先将孔内液体甩出包被板。解决办法1.禁止手工洗板。 2.保证洗液注满各孔。3.洗板时注意观察是否有堵孔现象，保持洗板针畅通。4.合理安排操作（洗板）时间。5.洗板前不要先将孔内液体甩出包被板，以免酶液沾于孔边缘。19(4)洗板过程中易出现的问题1.采用手工洗板,孔与孔之间液体(5)显色过程中易出现的问题1.显色剂配制后放置时间过长或使用已经变色失效的显色剂 2. 用

10、排枪加A、B混合液时，加样槽不够干净，造成花板3.不同厂家试剂的显色液混用20(5)显色过程中易出现的问题1.显色剂配制后放置时间过长或使(6)终止和读数时的注意事项1加完终止后30分钟内读取数据。2读板时板底如果不清洁，就会导致所读的数据不准确，所以在读数前尽量保证酶标板的底部是清洁的。 21(6)终止和读数时的注意事项1加完终止后30分钟内读取数据酶联免疫吸附试验优缺点优点1、价格低2、一般实验室均可操作3、不需特殊仪器设备4、适用于大面积查体缺点1、易出假阳性2、不适用于单个样本测定22酶联免疫吸附试验优缺点优点22快速检测法优先使用项目包括: VCT、母婴传播、临床评估、农村血检、术前

11、检测、紧急事件等。技术角度的考虑包括:需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链运输环节、小空间实验室的成本效益、 检测的简单性等。23快速检测法优先使用项目包括: 23快速检测反应模式免疫层析实验渗滤实验（间接法/双抗原夹心法）24快速检测反应模式24免疫层析实验样本：血浆/血清/全血（唾液）不同部位固定不同抗原可区分HIV-1/HIV-2,质控线：抗人IgG一般需时15-30min弱阳性结果较难判断+Y+YHIV抗原HIV特异性抗体 金标HIV抗原显色25免疫层析实验样本：血浆/血清/全血（唾液）+Y+YHIV抗原 HIV 使用试验步骤将检测条的外包装撕去 血清和EDTA抗凝血浆 EDTA抗凝

12、全血加入50 uL样品 加入 50 uL样品 过15分钟读结果 加1滴示踪缓冲液 最多60 分钟(HIV) 过15分钟读结果 最多60 分钟(HIV)26 HIV 使用试验步骤26结果解释 阳性 阴性 无效 无效15分钟后读结果，对结果的解释不要超过1小时。27结果解释 阳性 阴性 检测要注意问题Determine HIV-1/2 试验只能使用人类血清、血浆和全血，对其他标本结果可能不准确。反应线的强度不一定与标本中的抗体滴度相关。含EDTA以外抗凝剂的全血或血浆标本给出的结果可能不正确。阴性结果应当与临床症状和风险因子一起考虑。阳性结果应当用第二种方法证实。结合临床证据对结果做过评价后才能作

13、出诊断。28检测要注意问题Determine HIV-1/2 试验只能使2929渗滤实验原理：双抗原夹心法样本:血浆/血清（若有过滤装置，则可测全血）可将抗原固定于不同位置，区分HIV-1和HIV-2实验需几步：加样本，加洗液，加信号试剂。一般在5-15min完成弱阳性结果较难判断+Y+YHIV抗原HIV特异性抗体 金标HIV抗原显色30渗滤实验原理：双抗原夹心法+Y+YHIV抗原HIV特异性抗体免疫渗滤原理的产品构造示意图31免疫渗滤原理的产品构造示意图31结果32结果32优点：快速、简便、易操作可检测100份以内小批量样品需要很少的设备和试剂检测地点可扩展到实验室以外只需对技术人员做适当培

14、训大部分为一步法在短时间(30分钟)内出结果结果易目测判读可在室温下保存33优点：快速、简便、易操作可检测100份以内小批量样品33缺点 不宜一次检测100份以上的大批量样品比ELISA法价格略高。结果判读不客观，易受主观因素影响34缺点 不宜一次检测100份以上的大批量样品34快速检测试剂选择 1.必须使用经国家食品药品监督管理局注册批准的快速试剂； 2.试剂必须在有效期内使用； 3.根据检测目的，选择试剂初筛选择敏感性高的试剂，复检选择特异性高的试剂；4.推荐使用临床评估质量好并且近几年连续考评结果稳定的试剂。 35快速检测试剂选择 1.必须使用经国家食品药品监督管理局注册批3636三代与

15、四代比较（快速试剂）四代试剂不仅可以检测出血清/血浆/全血样本中的HIV-1和HIV-2抗体，还可以检测出p24抗原。p24抗原是感染HIV病毒后产生的一种蛋白质，比HIV抗体出现的要早，在艾滋病感染初期、窗口期内可以通过检测p24抗原来判断是否感染HIV。四代试剂比三代试剂平均提前5天可以检测出HIV感染者。灵敏度为92.31%，特异性为99.66%。目前国内尚未上市37三代与四代比较（快速试剂）四代试剂不仅可以检测出血清/血浆/复核试验方法选择替代组合WB检测结果阳性一致率（%）EIA1 +RT135100100EIA1 +RT234900100RT1+EIA135100100RT1+EI

16、A233800100RT1+RT23575098.5EIA1+EIA23341099.738复核试验方法选择替代组合WB检测结果阳性一致率（%）E免疫层析结果判读记录仪39免疫层析结果判读记录仪394040自动生成报告41自动生成报告41结果导出Excel42结果导出Excel424343免疫层析结果判读记录仪优点： 1.检测结果的保存 2.自动生成报告 3.结果可导出缺点： 1.不适合批量操作44免疫层析结果判读记录仪优点：44快速检测，是艾滋病实验室多了一种检测方法。快速检测，是为了更多、更快的的发现感染者。快速检测，不是为了取代实验室，但不能因为有了实验室而放弃使用快速检测。45快速检测

17、，是艾滋病实验室多了一种检测方法。45明胶颗粒凝集试验（PA）将提纯后的HIV抗原连接到有色明胶颗粒上，制成致敏颗粒。当加入的检测标本中有HIV抗体存在时，即可使致敏颗粒凝集，出现肉眼可见的浅色凝集环（斑）；而若标本中无HIV抗体，致敏颗粒即在重力作用下沉人U型板底，形成一个深色红点。46明胶颗粒凝集试验（PA）将提纯后的HIV抗原连接到有色明胶颗1、加入样品稀释液孔号75l25l25l13212、加入测试样品25l孔号1321弃去3、样品倍比稀释孔号1321最终稀释倍数1：1625l25l25l1：8471、加入样品稀释液孔号75l25l25l13212、加5、混匀，加盖，室温2个小时6、结

18、果判读致敏颗粒4、加入明胶颗粒最终稀释倍数孔号13211：32未致敏颗粒25l25l1：16485、混匀，加盖，室温2个小时6、结果判读致敏颗粒4、加入明胶4949优点：凝集试验具有操作简便，经一步即可迅速得出结果，不需任何仪器等优点该方法的敏感性及特异性与EL1SA方法相近不需特殊仪器该方法的敏感性及特异性与EL1SA方法相近溶血标本不影响结果缺点与不足：判定结果用肉眼观察，无法保存。 为了保存试验结果，需配备数码相机。应选用高质量的U型板50优点：缺点与不足：50唾液检测试剂Oralquick51唾液检测试剂Oralquick51用一次性采样环收集约 5 l 血样用采样盘沿上/下牙床外表面

19、采样一周 将样本转入小瓶 中搅动唾液检测试剂Oralquick52用一次性采样环收集约 5 l 血样用采样盘沿上/下牙床外表插入检测设备 20分钟后读取结果 无效阴性阳性53插入检测设备 20分钟后读取结果 无效阴性阳性53优点:简单、易操作、反应时间短适用于吸毒人群缺点：价格高影响因素多（口腔杂质、反应温度等）54优点:544.化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence immunoassay）化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其特点在于灵敏度高、测定范围宽、使用范围广 ，快速、简便，并在测试中不使用有害试剂

20、，无放射污染等。554.化学发光免疫分析技术（Chemiluminescenc化学发光检测使窗口期由43.6天缩短为38.3天，虽然只缩短了12.2%，但却将残余风险降低了46.4%。数据来源: Residual risk of transfusion-transmitted viral infections in Shenzhen, China, 2001 through 2004方法学窗口期（天）残余风险ELISA43.61/17501CLIA38.31/32637可以降低残余风险56化学发光检测使窗口期由43.6天缩短为38.3天，虽然只缩短评估本次评估使用随机抽样方式抽取已知血清标本

21、1556份，其中阳性标本 501份，阴性标本为 1055 份。科美东雅：灵敏度100%；特异度99.43%；准确度99.61%。阿克苏： 灵敏度100%；特异度99.15%；准确度99.42%结论：科美东雅CLIA试剂HIV抗体初筛结果与生物梅里埃（Ag+Ab）ELISA试剂比较有较高的灵敏度、特异性。统计分析表明：二者准确度显著性检验无差异(u=0.7765，u1.96， P0.05)。将第一次两种试剂检出的15份假阳性标本（科美东雅6份，生物梅里埃9份），分别进行重复检测，结果均阴性。二次结果汇总统计：两种试剂检测结果一致，符合率为100%。57评估本次评估使用随机抽样方式抽取已知血清标本

22、 1556份，其HIV-1新发感染血清学方法检测美国已将用BED方法监测新发感染率纳入了国家艾滋病常规监测体系，全美所有需要进行新发感染检测的样品均寄至纽约州公共卫生实验室，统一检测，统一质控，统一数据处理。2006年6月美国CDC发布了“资源有限国家BED检测/监测HIV-1新发感染指南” 性病艾滋病预防控制中心于2004年将该方法引进国内。建立了适合于我国的BED方法的窗口期（168天）和4个关键校正系数（=0.8098，=0.7571，=0.9315，=0.0685） 58HIV-1新发感染血清学方法检测美国已将用BED方法监测新发原理其原理是根据HIV特异性IgG占总IgG抗体的比例随

23、着感染时间的延长而逐渐增高。应用BED-CEIA进行新近感染检测只适用于HIV阳性样品。由于个体间抗体生成的变异性，对个体而言，BED结果的预测值偏低，而且在个体水平上，BED检测可能产生一定的假阳性和假阴性，但在人群水平上，假阳性的数目与假阴性的数目相近，因此可以相互抵消彼此的作用。美国FDA将BED-CEIA归为“只应用于监测目的，不能用于个体诊断和临床”的实验方法。59原理其原理是根据HIV特异性IgG占总IgG抗体的比例随着感6060建议：各实验室尽量多参加实验室能力验证（PT）工作！国家级PT艾滋病抗体筛查和确证 3次/年梅毒抗体 3次/年乙肝表面抗原 3次/年HCV抗体检测 3次/年WB条带判读 3次/年BED 2次/年CD4检测 2次/年耐药检测 2次/年基因序列判读 1次/年滤纸片干血斑HIV-DNA 1次/年省级PT筛查实验室 1次/年筛查中心实验室 2次/年61建议：各实验室尽量多参加实验室能力验证（PT）工作！国家级三、职业暴露62三、职业暴露626363646465656666676768686969707071717272737374747575机构分布2011年，26个省份（系统）报告有艾滋病防治工作人员发生职业暴露，总例数为1043（比2010年增加15.4% ）765例暴露者及时服用了抗病毒药物，