亚硒酸钠对肝癌细胞发生自噬影响课件

1、自噬抑制剂3-MA克服肝癌细胞索拉菲尼耐药的作用及机制研究专业：普通外科导师：王世明教授硕士研究生：梁源1自噬抑制剂3-MA专业：普通外科1 立论依据 研究现状 研究方案 目录1234 研究基础5 参考文献2 立论依据 肝癌 肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，我国已成为全球肝癌发病率最高和死亡最多的国家。我国肝癌发病约347万人年，占到全球的55；而死亡323万人，占全球的45，因此，肝癌是一种具有“中国特色”的癌症，严重地威胁人民健康和生命。 立论依据 研究背景（一）3 肝癌 A期（早期）B期 （中期）C期（晚期)D期（终末期）53.927.115.32.6按照BCLC分期，肝癌患者分布情况

2、调查结果：诊断为肝癌患者中53为晚期4A期（早期）B期 （中期）C期（晚期)D期（终末期）53.9 研究背景（二） 索拉菲尼 近年来，分子靶向药物治疗肝癌已成为新的研究热点。其中索拉非尼(Sorafenib，商品名：Nexavar，多吉美)治疗肝癌在临床研究中取得了突破性进展，能够有效地阻止病情恶化，明显地延长晚期肝癌患者的生存时间，成为第一个可以显著延长晚期肝癌患者生存期的系统治疗药物和新标准 立论依据5 研究背景（二） 索拉菲消融术 0期PST 0, ChildPugh A级极早期（0） 1 HCC 2cm原位癌早期 (A)1个 HCC或3个结节2, ChildPugh C级HCC中期 (

3、B)多结节，PST 0AC期PST 02, ChildPugh AB级索拉非尼BCLC分期和治疗策略(2010) 推荐索拉非尼作为晚期HCC标准治疗 Alejandro F,Maria ER,Carlos R,et al.Semin Liver Dis .2010;30:61-74.6消融术 0期PST 0, ChildPugh A级极早期索拉非尼被各大指南推荐为标准用药美国国家综合癌症网（NCCN）肝癌临床实践指南美国肝病研究协会（AASLD）肝癌临床治疗指南巴塞罗那（BCLC）肝癌分期和治疗策略 亚太肝病学会（APASL）肝癌治疗指南原发性肝癌规范化诊治专家共识（中国） 日本肝脏病学会（J

4、SH）共识肝癌治疗策略欧洲（EASL-EORTC）肝癌临床实践指南7索拉非尼被各大指南推荐为标准用药美国国家综合癌症网（NCC索拉非尼34. Li Liu, et al. Cancer Res. 2006;66:11851-58 .抑制血管生成VEGFPDGF抑制肿瘤细胞增殖（抑制种子生长）残余肿瘤细胞微小病灶循环肿瘤细胞抑制肿瘤血管生成（使土壤贫瘠）索拉非尼的双重抗肿瘤作用8索拉非尼34. Li Liu, et al. Cancer 索拉菲尼抗肿瘤作用索拉菲尼通过抑制PI3KAktmTORp70S6K信号通路的磷酸化。促进凋亡，同时激活自噬性程序性死亡。活化JNK途径诱导肝癌细胞发生自噬性细

5、胞死亡索拉菲尼9索拉菲尼抗肿瘤作用索拉菲尼通过抑制PI3KAktmTOR型程序性细胞死亡：凋亡型程序性细胞死亡：自噬坏死细胞死亡方式研究背景（三）自噬及凋亡的关系10型程序性细胞死亡：自噬坏死细胞死亡方式研究背景（三）自噬及 自噬模式图 研究背景11 自噬模式图 研究背景11 研究背景坏死凋亡12 研究背景坏死凋亡12自噬及凋亡的关系1自噬抑制凋亡：自噬通过降解受损蛋白损伤等途径抑制凋亡。2自噬促进凋亡：自噬自身并不引起细胞死亡，但它为凋亡小体的形成和吞噬作用提供能量，从而促进凋亡的发生。3自噬及凋亡共存并可相互转换：在自噬晚期使用特异性自噬抑制剂则使自噬性死亡转向凋亡，有文献报道imatin

6、ib可以致恶性神经胶质瘤细胞发生自噬性死亡，然而在自噬晚期使用自噬抑制剂可使自噬性死亡转向凋亡，而当细胞凋亡被抑制剂阻断细胞则转向自噬，此时不论抑制凋亡还是自噬，细胞均转变为另一条途径的细胞死亡。 研究背景13自噬及凋亡的关系1自噬抑制凋亡：自噬通过降解受损蛋白损伤等自噬对肿瘤的双重作用 研究背景目前对自噬对肿瘤中到底是其抑制还是保护作用仍是倍具争议。（1）一方面，自噬可以杀死肿瘤细胞。（2）另一方面，自噬可以保护肿瘤细胞。由于肿瘤细胞具有高代谢的特点，肿瘤持续快速增大营养供应不足，自噬被激活将损伤的细胞器及蛋白降解成可利用的活性成分，供给给肿瘤细胞来度过这一危机。这一过程及肝癌细胞对索拉菲尼

7、耐药形成相关。14自噬对肿瘤的双重作用 研究背景目前对自噬对肿瘤中到凋亡自噬自噬肝癌索拉菲尼耐药机制（一）凋亡自噬激活后，一方面，降解受损细胞器及蛋白为肿瘤提供营养。另一方面抑制凋亡，减少肿瘤细胞坏死。使得癌细胞存活。自噬对肿瘤形成了保护作用。该过程降低了肝癌细胞对于索拉菲尼的敏感性。我们推测这是是肝癌细胞对索拉菲尼耐药形成原因之一。3MA肿瘤持续快速增大营养供应不足1.索拉菲尼通过抑制P13KAktmTORp70S6K信号通路的磷酸化。促进凋亡，激活自噬。2.活化JNK途径诱导肝癌细胞发生自噬性细胞死亡 激活早期晚期抑制 研究现状干预15凋亡自噬自噬肝癌索拉菲尼耐药机制（一）凋亡自噬激活后，

8、一方面2.PI3k/Akt通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性耐药 PI3k/Akt是促进细胞自噬发生的重要传导通路。PI3k可被生长因子等刺激物激活生成PIP3，再激活其下游的Atk蛋白继而磷酸化其一系列底物，从而达到对细自噬的调控。该通路的激活及肿瘤细胞的耐药性的产生密切相关。研究发现耐药细胞中pAkt有明显上调。而抑制Akt的表达，则可逆转耐药细胞对索拉非尼的耐药性。该研究结果表明，PI3k/Akt通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性耐药。 研究现状肝癌索拉菲尼耐药机制（二）16 研究现状肝癌索拉菲尼耐药机制（二）16. 本研究构建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型，观察自噬抑制

9、剂3-MA对裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型皮下移植瘤的作用。并检测 PI3KAKT途径及JNK途径相关蛋白水平。探讨自噬抑制剂3-MA是否通过上述途径抑制自噬，代偿性激活凋亡，增加耐药肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性，对耐药性形成克服或逆转，从而抑制肿瘤生长，为临床上治疗对索菲拉尼耐药的肝癌患者的用药提供实验依据。 研究目标17. 本研究构建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型， 肝癌索拉菲尼耐药细胞株的体外培养 建立移植瘤裸鼠模型空白对照组 索拉菲尼组3MA+索拉菲尼组低剂量组高剂量组高剂量组低剂量组肿瘤形态学观察 观察结束后取肿瘤组织及细胞组织绘制体质量曲 线称取肿瘤组织重量计算抑瘤率Western b

10、lotting 检测pAtk、pJNK、Caspase3表达免疫组织化学染色法检测pAk 、pJNK透射电镜观察自噬体及免疫荧光检测MAP1-LC3噬水平结果分析及统计处理 研究内容及 技术路线图18 肝癌索拉菲尼耐药细胞株的体外培养 （1）统计数据用SPSS20.0 软件包进行分析。（2）实验数据均以均数标准差表示。（3）采用单因素方差分析。 统计方法19 统计方法19（1）成功建立人肝癌细胞索菲拉尼耐药株鼠移植瘤的动物模型（2）需继续查阅大量文献确定小鼠灌胃给药浓度及剂量;（3）熟练掌握干预动物给药方式。 （4）检测各个指标的实验技术方法需熟练掌握； 拟解决关键问题20 拟解决关键问题20

11、实验室及实验器材等完备、试剂的完备，已基本掌握动物饲养、免疫组化等试验操作的基本要领。已参阅大量相关文献立论依据充分，且经费已经落实导师带领的团队进行了大量关于自噬的研究可作为前期研究工作积累Product A 研究基础及可行性分析21实验室及实验器材等完备、试剂的完备，已基本掌握动物饲养、免疫预期研究成果231索拉菲尼及自噬抑制剂3-MA联用可克服肝癌细胞对索拉菲尼的耐药，明显增强索拉菲尼治疗肝癌效果自噬抑制剂可逆转肝癌细胞对索拉菲尼耐药，可能通过抑制及自噬有关的PI3KAKT途径及JNK途径。发表1-2篇论文 预期研究成果22预期研究成果231索拉菲尼及自噬抑制剂3-MA联用可克服肝癌提出

12、了一种新的具有潜在应用价值的辅助治疗肝癌的新思路。裸鼠体内水平研究自噬克服肝癌细胞索拉菲尼耐药作用及机制研鲜有报道 1 2本课题创新之处23提出了一种新的具有潜在应用价值的辅助治疗肝癌的新思路。裸鼠体2015.01 -2014.04 2015.06-2015.08查阅文献撰写综述及开题报告培养细胞,裸鼠造模。各组各项指标的测定统计分析2015.08-2015.102015.04-2015.06撰写毕业论文准备答辩研究计划及预期进展242015.01 -2014.04 2015.06-2015.支出科目 金额（万元） 计算根据及理由合计 0.6科研业务费 0.02 文献检索、打印、论文装订 实验

13、材料费 0.5 实验试剂、材料、药品仪器设备费协作费 0.05 指标检测 研究组织实施费 0.03 日常研究组织. 经费预算25支出科目 金额（万元） 计算根据及理1.Wilson, G.S., et al., Tumoricidal effects of the JAK inhibitor Ruxolitinib (INC424) on hepatocellular carcinoma in vitro. Cancer Letters, 2013. 341(2): p. 224-230. 2.Chen, K.F., et al., Activation of Phosphatidylinos

14、itol 3-Kinase/Akt Signaling Pathway Mediates Acquired Resistance to Sorafenib in Hepatocellular Carcinoma Cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2011. 337(1): p. 155-161. 3.聂艳丽 and 南克俊, 分子靶向药物在肝细胞肝癌治疗中的研究进展. 现代肿瘤医学, 2014(8): p. 1996-1999. 4.胡博, et al., 姜黄素纳米粒(NanoCurcTM)联合索拉非尼

15、对肝细胞癌(HCC)的协同抑制作用. 复旦学报（医学版）, 2014. 41(2): p. 143- 148. 5.畅建平, 细胞自噬在肝癌发生发展中的作用. 肿瘤研究及临床, 2014. 26(5): p. 358-360. 6.朱云, 程旸 and 李爱民, 原发性肝细胞癌对索拉非尼耐药机制的研究进展. 中国药理学通报, 2013. 29(6): p. 752-755. 7.任金妹, et al., 姜黄素抗肿瘤及逆转多药耐药的研究进展. 中国药师, 2013. 16(10): p. 1582-1585. 8. Maiuri MC，Zalckvar E，Kimchi A，et alSelf

16、-eating and selfkilling：erosstalk between autophagy and apoptosisJNat RevMol Cell Bi012007，8(9)：741-752 9.Rautou PE，Mansouri A，Lebreec D，et al、Autophagy in liver diseasesJJ Hepatol，2010，53(6)：1123一1134 10. Clark S JCellular differentiation in the kidneys of newborn micestudies with the electron micr

17、oscopeJJ Biophys Biochem Cytol，1957，3(3)：349-362 参考文献261.Wilson, G.S., et al., Tumor 11.代景友, 抑制自噬对肝癌耐药性的影响及机制研究. 2013, 哈尔滨医科大学. 12.郝慧瑶, 索拉菲尼诱导肝星状细胞程序性细胞死亡的作用及其机制研究. 2013, 河北医科大学.13.刘捷, et al., 靶向肿瘤细胞自噬通路的植物天然产物研究进展. 国际药学研究杂志, 2013(06): p. 688-694.14.傅思睿 and 陆骊工, 索拉菲尼在肝癌靶向治疗中的应用. 中华医学杂志, 2012. 92(29)

18、: p. 2084-2086.14.傅思睿 and 陆骊工, 索拉菲尼在肝癌靶向治疗中的应用. 中华医学杂志, 2012. 92(29): p. 2084-2086. 15.姚超, et al., 索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及其生物学特性. 第三军医大学学报, 2012. 34(14): p. 1366-1369. 16.张栋, et al., PI3K/Akt信号转导通路及卵巢癌顺铂耐药相关性的研究. 天津医药, 2011(04): p. 361-363. 17. Yang Z，Klionsky DJEaten alive：a history of maeroautophagyJNa

19、t Cell Biol，2010，12(9)：814-822 18. Mizushima NThe pleiotropic role of autophagy：from protein metabolismto bactericideJ，Cell Death Differ，2005，12(Suppl2)：15351541. 19. Klionsky DJ，Cregg JM，Dunn WJ，et a1A unified nomenclature for yeast autophagy-related geuesJDev Cell，2003，5(4)：539-54520.Mizushima N，Y

20、amamoto A，Hatano M，el alDissection of autophagosome formation using Ap95一deficient Iouse embryonic stem cellsJJ Cell Biol，2001，152(4)：657-668 参考文献27 参考文献2721.李先亮 and 陈大志, 硬化型肝癌靶向治疗的目标及应用进展. 中华肝胆外科杂志, 2011. 17(12): p. 963-968. 22.杜海磊, et al., 索拉非尼抑制肝癌细胞增殖中自噬的作用及其机制. 外科理论与实践, 2011(03): p. 270-274.23.穆

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22、.Deatll witllout caspases，caspases without deatIhJTrends cell Biol，2004，14(4)：184一19326.DuH，YangW，Chen L，et a1Emergingrole of autophagy during ischemiahypoxia and reperfusion in hepatoeellular carcinomaJInt J Oncol，2012，40(6)：2049-2057 27.Yang PM，Liu YL，Lin YC，et a1Inhibition of autophagy enhanees anticaneer effects of atorvastatin in digestive malignanciesjCancer Res，2010，70(19)：7699-770928.黄秀兰, 崔国辉 and 周克元, PI3K-Akt信号通路与肿瘤细胞凋亡关系的研究进展. 癌症, 2008(03): p. 331-336.29.秦叔逵 and 龚新雷, 索拉非尼治疗原发性肝癌的研究进展. 临床肿瘤学杂志, 2008. 13(12): p. 1057-1068. 参考文献282