猪伪狂犬病的PCR诊断课件

1、实验七 猪伪狂犬病PCR诊断猪伪狂犬病的PCR诊断1实验七 猪伪狂犬病PCR诊断猪伪狂犬病的PCR诊断1实验目的：1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；2、掌握猪伪狂犬病毒PCR检测的方法；实验内容：1、讲述PCR反应的原理、方法及操作步骤，2、猪伪狂犬病毒PCR检测。猪伪狂犬病的PCR诊断2实验目的：1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤；实验内容什么是PCR？ 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。一、PCR反应的原理、方法及操作步骤猪伪狂犬病的PCR诊断3什么是PCR？ 聚合酶链

2、式反应（Polymerase ChaPCR原理 PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。猪伪狂犬病的PCR诊断4PCR原理 PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其PCR原理PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等

3、条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环 （2530次）过程，使目的DNA呈指数扩增 。猪伪狂犬病的PCR诊断5PCR原理PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适B反应程序变性：93-94 2min变性：93-94 30s复性：55-65 30s延伸：72 30s延伸：72 2min35个循环猪伪狂犬病的PCR诊断6反应程序变性：93-94 2min35个循环猪伪狂PCR原理Sample denaturatationPrimer annealingPrimer extension猪伪狂

4、犬病的PCR诊断7PCR原理Sample denaturatation猪伪狂犬PCR product猪伪狂犬病的PCR诊断8PCR product猪伪狂犬病的PCR诊断8标准的PCR反应体系10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul猪伪狂犬病的PCR诊断9标准的PCR反应体系10扩增缓冲液 猪伪狂犬病的PCR诊断10猪伪狂犬病的PCR诊断10酶及其浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大

5、肠菌合成一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少猪伪狂犬病的PCR诊断11酶及其浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应猪伪狂犬引物引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增猪伪狂犬病的PCR诊断12引物引物是PCR特异性反应的关键猪伪狂犬病的PCR诊断12引物在线设计网址：primer/primer3_猪伪狂犬病的PCR诊断13引物在线设计网址：猪伪狂犬病

6、的PCR诊断13猪伪狂犬病的PCR诊断14猪伪狂犬病的PCR诊断14猪伪狂犬病的PCR诊断15猪伪狂犬病的PCR诊断15PCR产物分析 凝胶电泳分析法 可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小。 同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。猪伪狂犬病的PCR诊断16PCR产物分析猪伪狂犬病的PCR诊断16二 猪伪狂犬病毒感染PCR检测-试剂盒猪伪狂犬病的PCR诊断17二 猪伪狂犬病毒感染PCR检测-试剂盒猪伪狂犬病的PCR猪伪狂犬病的PCR诊断18猪伪狂犬病的PCR诊断18使用方法猪伪狂犬病的PCR诊断19使用方法猪伪狂犬病的PCR诊断19注意事项：猪伪狂犬病的PCR诊断20注意事项：猪伪狂犬病的PCR诊