实验三酶联免疫吸附试验ELISA课件

1、1.酶联免疫吸附试验（ELISA)1.酶联免疫吸附试验（ELISA)免疫标记技术定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP免疫标记技术定义：免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分

2、类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.分类间接法（Indirect ELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（Sandwich ELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（Competitive ELISA) ：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记

3、抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immuno酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)3. 原理（以间接性ELISA为例）：显色酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immuno实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测实验内容： 间接法测定溶血素 定性检测实验材料脱纤维绵羊红细胞 抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素） 待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG 二抗包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS底物缓冲液： p

4、H5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40L酶标板，酶标仪实验材料脱纤维绵羊红细胞 抗原实验方法1.抗原的处理：脱纤维绵羊血加3mL N.S，混匀2000rpm，5min加3mL N.S，混匀2000rpm，5min取2mL压积红细胞加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞用包被缓冲液稀释成1：400备用2.包被抗原：取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液4，湿盒内，18h实验方法1.抗原的处理：脱纤维绵羊血加3mL N.S，混匀2取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔，

5、加入相应液体100L/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗：37，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标二抗100L/孔37，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100L/孔避光显色，10min6.观察结果实验方法取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（2预期结果阳性：显色为黄色阴性：无色1 2 3 4阴性阴性阳性阳性预期结果阳性：显色为黄色1 2 3 4注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。

6、2.补体结合反应（Complement fixation Test, CFT）2.补体结合反应（Complement fixation 概念： 补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。概念： 补体结合反应：补反中包括两个系统五种成分：待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：补反中包括两个系统五种成分：原理：待测系统抗原+未知血清1 2补体12Step 1 抗原抗体复合物的形成Step 2补体的结合和耗竭指示系统SRBC+抗SRBC抗体Step

7、3SRBC的裂解121：No Ab； 2：Ab待测系统1 2补体12Step 1 Step 2指示系统SAgY待测血清 YYYYYYYYAb阳性No Ab阴性AgAgAgAgY待测血清 YYYYYYYYAbNo AbAgAgAg抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：56，30min补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞溶血素材料：抗原：伤寒菌裂解产物材料：方法：12345试验管血清对照管抗原对照管补体对照管SRBC对照管待测血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原补体 N.S摇匀，37，水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL 摇匀，37，水浴15min（1份/2人）方法：12345试验管血清抗原补体SRBC待测血清0.2mL预期结果：1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。溶血不溶血2. 试验管血清对照管抗