荧光定量PCR课件

1、荧光定量PCR荧光定量PCR的概述操作步骤数据分析常见问题4123目录荧光定量PCR的概述1 什么是荧光定量PCR？ 荧光定量 PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR的概述2 荧光定量PCR的工作原理Ct 值的 含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。指数期平台期 反应最初，虽然产物是指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加（图中 1-18 个循环）。当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即 CT。由于 CT

2、值处于指数期内，这时的反应成分不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量 PCR 结果是可靠的，可以准确地反映反应体系中模板的初始量。 CT 值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的，且模板的初始浓度越大，CT值越小。荧光定量PCR的概述2 荧光定量PCR的工作原理荧光定量PCR的概述2 荧光定量PCR的检测方法扩增序列非特异性检测in here除了引物，还需设计与模板相结合的分子探针 成本高荧光分子结合DNA 只需要引物和荧光分子 方法简便，降低成本 易产生假阳性扩增序列特异性检测特异性高，结果不易出现假阳性荧光定量PCR的概述2 荧光定量PCR的检测方法非特异性荧光定量PCR（以SYBR为例）

3、SYBR Green 荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号。游离状态下的SYBR只能发出微弱的荧光，但是与DNA结合后，荧光倍数会增加1000倍，因此可以通过荧光的强度来判断双链DNA的数量。 对于假阳性的结果，可以通过溶解曲线来判断。荧光定量PCR的概述2 荧光定量PCR的检测方法特异性荧光定量PCR（以Taqman为例） TaqMan探针是一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团，因此探针完整时，检测不到该探针 5端荧光基团发出的荧光。但在 PCR 扩增中，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，Taq 酶的 5-3外切将探针酶切

4、降解，使荧光发射基团与淬灭基团脱离，从而检测到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。操作步骤操作步骤1 准备阶段实验材料与试剂枪头、枪头盒、 EP 管和八连管等需提前灭菌cDNA分装，避免反复冻融引物稀释引物为100M，-20保存使用时再进一步稀释，保证反应体系中引物浓度为0.4M内参-actin，GAPDH 等等操作步骤2 加样操作制定加样体系根据不同的试剂盒和实验样本量（cDNA量），选用不同的反应体系设置空白对照每一次加样和每一对引物都应该设置空白对照，即不加入模板，至 少重复3次，这样可以降低实验误差混匀分装可以先将

5、引物、酶、水和荧光分子混合，分装后加入模板，且每一 次混合应多混合几管，避免分装过程的损耗操作步骤3 上机操作（以bio-rad为例）1）启动bio-rad荧光定量PCR仪，开启荧光定 量检测系统CFX Manager v1.6。2）选择 file- New-experiment 3）选择两步法+溶解曲线（检测目的产物的特异性，如果是探针法则不需要溶解曲线）的温度梯度程序 ，点击“edit selected”。操作步骤4)程序与参数输入最佳退火温度反应体系与加样一致照相机的添加是为了实时监测荧光信号操作步骤5）编辑排布信息板子的排布和放置样品时的位置相同荧光分子类型编辑信息，便于数据统计操作步

6、骤6）setting 中 plateType 是白管就选择白管，透明管就选择透明管。然后选中白管放置位置，Smple Type 选择 unkown，勾选上 SYBR（探针就勾选探针）7）然后 start run-close lid start 就可以了。数据分析相当量的肿瘤组织和正常组织比，p53 mRNA 改变了多少倍 相对定量给定的血样中的病毒颗粒数 绝对定量数据分析可以采用两种方式数据分析1 绝对定量 绝对定量是通过样品的 CT 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总 RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。当你想找出一个给定样品的本质属性的时候，

7、就应该使用绝对定量。例：医生对一个病人的每毫升血液中病毒颗粒数感兴趣。所以医生从 10 毫 升血液中提取 DNA，然后通过对病毒 DNA 特异的荧光定量 PCR 检测确定病毒颗粒的数目。通过待测样本的 CT 值和已知病毒颗粒数的标准曲线进行比较，医生能够确定在分析的 DNA 样品中有 10000 个病毒。基于以上信息，她能够确定每毫升血中有 1000 个病毒。数据分析制作一直基因拷贝数标准品的标准曲线构建曲线方程式检测样品的CT值，带入方程，算出单位样品的基因拷贝数。数据分析 相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品 A）和对照组（样品 B）中一个靶基因的相对比率（倍数差异）。2 相对定量

8、例：研究者分别从 1,000 个癌变的和 1,000 个正常卵巢细胞中提取 RNA，对样本进行 p53 mRNA 特异地反转录定量 PCR 实验 (RT-qPCR) 确定 p53 mRNA 的量，结果显示了从等量癌变的和正常卵巢细胞中提取的 RNA 样本中 p53 mRNA 分子数目的比率，即是 p53 mRNA 的差异倍数。数据分析通常采用2CT 法进行计算（目标基因和参照基因有相似且接近 100% 的扩增效率）。首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的 CT 值归一目标基因的 CT 值：CT(test)= CT(target, test) CT(ref, test)CT(calibra

9、tor)= CT(target, calibrator) CT(ref, calibrator)其次，用校准样本的 CT 值归一试验样本的 CT 值：CT = CT(test) CT(calibrator)最后，计算表达水平比率：2CT = 表达量的比值常见问题Q-1. 无Ct值（信号）出现A1. 反应循环数不够:一般都要在35个循环以上，可根据试验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号A2. 检测荧光信号的步骤有误：一般采用72延伸的采集。A3. 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性。A4. 引物或探针的设计：如探针高于引物的温度不够，造成探针为杂交上，而产物已延伸的情

10、况A5. 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起A6. 模板降解：避免样品制备中杂志的引入及反复冻融常见问题Q-2.阴性对照也出现明显扩增A1. mix或水被污染。A2. 引物二聚体的出现: 在35cycles以后阴性出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线分析。A3. 反应过程探针的降解：用PAGE电泳对探针进行检测。Q-3.融解曲线不止一个主峰A1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。A2. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。A3. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。A4. 模板有基因组的污染：RNA

11、提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。常见问题Q-4. Ct值出现过晚A1. 扩增效率低，反应条件不够优化：设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。A2. PCR各种反应成分的降解或加样量不足。A3. PCR引物太长：一般采用80-150bp的产物长度。Q-5.标准曲线的线性关系不佳A1. 加样存在误差，使标准品不成梯度。A2. 标准品出现讲解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。A3. 引物或探针不佳：重新设计更好的引物和探针。常见问题Q-6. 扩增效率低A1. 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。A2. 反应条件不够优化，可适当降低退火温度或改为三步扩增法A3. 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板是引入，可将引物湿度稀释，再加入反应体系中。Q-7. 实验重复性不好A1. 加样不准确。A2. 仪器在样品上温度条件有差异，即温度均一性不好。A3. 模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。常见问题Q-8. 变性时间和温度是否合适A1. 大部分的双链DNA在95就开始解链了，在有些情况下载90至94都不能很好地变性DNA。由于部分变性，参与反应的探针和引物相应的减少了，因此反应效率