分子荧光光度法

1、关于分子荧光光度法第1页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 第一节 概 述一、光致发光 物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。物质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光致发光。 荧光 10-910-6s 实用 磷光 10-310s 不实用二、荧光光度法 利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为荧光光度法，即荧光法。 第2页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 优点：灵敏度高，10-710-9g/ml，比紫外分光光

2、度法灵敏度高101000倍。第二节 基本原理一、荧光的产生 基态 激发光 激发态 去激发 基态（一）激发 处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中的一个电子被激发到某一较高能级。基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。激发态 激发单重态 S1 S2 激发三重态 T1 T2 (二)去激发 指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射方式回到基态的过程。第3页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 辐射跃迁 荧光去激发 磷光 振动驰豫 无辐射跃迁 内转移 （热的形式） 体系间跨越 外转移 1、振动驰豫 同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分

3、子，这一过程称振动驰豫。 2、内转移 两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式传递给溶剂分子。 第4页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 意义：无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态（如S1、S2、S3)，它都能通过内转移和振动驰豫到达S1的最低振动能级上。 一般情况下，S1与S0之间很难发生内转移；T1与S0之间发生内转移的几率要大些。3、体系间跨越 电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨越。常见于含重原子(I、Br)的有机分子中。4、外转移 激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式

4、失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称“猝灭”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很难见到磷光。第5页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 5、荧光发射 电子由第一激发单重态S1（最低振动能级）跃迁至基态S0而发射的光叫荧光。6、磷光发射 电子由第一激发三重态T1跃迁至基态S0而发射的光叫磷光。 跃迁方式 时间 振动驰豫 10-12 10-14 S 内转移 10-11 10-13 S 荧光 10-6 10-9 S 磷光 10-4 10 S 第6页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四二、影响

5、荧光的因素 荧光效率： f = 发射荧光的分子数 被激发的分子总数 荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。1、分子结构 (1)*跃迁能产生较强荧光。产生荧光的主要跃迁类型 (2)含-共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧光效率越大。 (3)刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。 (4)取代基效应：斥电子基f 吸电子基 f 重原子f第7页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四2、环境因素 (1)温度 温度荧光效率 (2)溶剂 极性 荧光 (3)溶液pH值 影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液pH值。 (4)荧光熄灭剂（卤素

6、离子、重金属离子等等）3、荧光物质浓度 自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。第8页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四原理图 荧光测量应在垂直激发光方向上进行。一、光源 特点：光强度大，适用范围宽。 常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，激光，脉冲激光二、单色器 干涉滤光片，光栅三、样品池 石英杯四、检测器 光电倍增管第三节 荧光光度计日立850型荧光分光光度计第9页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 第四节 定量分析方法原理：一定条件下，荧光强度（If)与浓度(c)呈线性关系。 If = Kc 定量分析的依据 方法：标

7、准曲线法和标准对比法第10页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四第五节 分析条件的选择 线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除一、线性范围的选择 荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。二、选择激发波长和荧光波长1、激发波长的选择激发光谱： 将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应的荧光强度，所得荧光强度-激发波长图谱，称激发光谱。 一般选择最大激发波长作为激发光波长。第11页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四2、荧光波长的选择 荧光光谱：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次测定所发

8、射的各波长的荧光强度，所得荧光强度-荧光波长图谱，称为荧光光谱。 一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。三、散射光干扰的排除1、散射光 当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。 瑞利散射光 波长与激发光波长一样 拉曼散射光 波长比激发光波长长第12页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四2、消除方法（1）选择适宜的激发光波长 用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的荧光峰位波长相同 ，但产生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。（2）选择合适的溶剂 拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。第13页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四 第六节 应 用 因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监测和卫生防疫等领域。第14页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四第15页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四4、5、6第16页，共20页，2022年，5月20日，11点15分，星期四返回第17页，共20