微阵列-比较基因组杂交技术及其在肿瘤研究中的应用

1、微阵列比力基因组杂交技能及其在肿瘤研究中的应用【摘要】微阵列比力基因组杂交(array-GH)技能是将DNA克隆或DNAs做成微阵列，取代传统GH法中中期染色体作为杂交靶，不但使区分率进步，乃至可以确定肿瘤相干基因并提供正确的定位。全文综述Array-GH的原理、要领及其在肿瘤学中的应用和意义。【关键词】微阵列-比力基因组微阵列比力基因组杂交(array-parativegenihybridizatin，Array-GH)技能是将DNA克隆或DNAs做成微阵列，取代传统GH检测中将中期染色体作为杂交靶举行检测，不但使区分率进步，而且还可以确定肿瘤相干基因并提供正确的定位。同时可经盘算机软件识别

2、每条染色体，落服了必要履历富厚的职员识别染色体的限定，为快速全面地阐发肿瘤构造DNA拷贝数的变革，以及染色体不不变性的检测提供了较为抱负的要领。本文就该技能原理、要领及其在肿瘤研究中的应用作一简朴的综述。1微阵列比力基因组杂交概述1.1Array-GH根本原理Array-GH与GH相似，但它是用DNA克隆或DNAs微阵列取代中期染色体铺片作为杂交靶，马上等量的差异荧光标识表记标帜的待测和参照DNA经人t-1DNA关闭非特异性重复序列后，同时杂交到由DNA克隆或DNAs构成的微阵列上。用微阵列每个靶点上的两种信号的荧光比例反响待测基因组DNA在相应的序列或基因上的拷贝数变革15。1.2要领微阵列

3、可以为DNA克隆微阵列和DNAs微阵列。DNA克隆是在BA、PA或YA载体中克隆的DNA片断。DNAs微阵列，可以从样本中提取总RNA，再分散RNA，然后将得到的DNAs举行PR扩增。用专门的仪器将DNA克隆或DNAs点样至覆盖特定介质的玻片上，根据在染色体中的漫衍，确定靶点的摆列挨次。为了得到正确的效果,每个靶点可重复点样210次。点样后，立即将玻片在80烘烤10in，制成微阵列玻片，存储在带有枯燥剂的盒子里，室温保存1，2，47。待测DNA可以来自肿瘤细胞系、冷冻或白腊包埋的肿瘤构造。应尽大概选择具有典范构造学特性的肿瘤细胞，弃除坏死构造和炎症区及周边正常细胞，以免滋扰。利用尺度的酚氯仿异

4、戊醇提取法分散肿瘤细胞和构造中的DNA。对付甲醛结实、白腊包埋构造,可以用激光捕捉显微切割法L得到肿瘤构造，提取DNA，再用变性引物介导的PRDP-PR扩增和标识表记标帜8，参照DNA泉源于康健人血液中的白细胞或同一患者同一器官中正常构造。对探针可以举行直接或间接荧光标识表记标帜。标识表记标帜要拥有以下几种：缺口平移法；随机引物法；DP-PR法；顺铂荧光素毗连法1，9等。标识表记标帜完成后用SephadexG5旋转柱去除未结合的核苷酸1。将差异荧光标识表记标帜的待测和参照DNA各1与人t-160混淆，关闭非特异重复序列，低落本底作用。然后将待测和参照DNA80热变性10in。37孵育12h，再

5、与已经预热的微阵列37杂交留宿，杂交后洗涤微阵列玻片，盖上盖玻片。对付DNA克隆微阵列，可以用DAPI复染，有助于定位靶克隆1，2，48。用共聚焦扫描装置或带有寒光源相机的光学装备猎取图像，并用专门的阐发软件处置惩罚数据。必要确定实际的靶地区、靶信号强度和局部配景强度。从靶信号强度中扣除局部配景得到靶荧光比例。将正常标本在微阵列全部靶点的均匀荧光比例调解为1，代表无DNA拷贝数变革。利用全部靶点的均匀荧光比例和尺度差s确定拷贝数变革的边界。得到和缺失别离界说为+2s和-2s，高程度扩增界说为2+2s7。阐发时去除在正常样本中荧光信号不知的点荧光信号超过配景20和有过多荧光残骸的点8。DNA拷贝

6、数图像可以用挪动均匀值vingaverage5个相邻的靶表现。挪动均匀值用于淘汰靶信号交织引起的偏向和低落配景8，9。1.3可行性检测和质量操纵Urban等10用有-glbin位点缺失的人用Array-GH法举行检考试证Array-GH检测染色体基因组缺失或扩增是否可靠，效果均检测到了缺失的存在，证实该芯片体系可以正确地检测基因或基因组的缺失。Veltan等11为用Array-GH法检测膀胱肿瘤患者DNA拷贝数变革，为确定该技能及该芯片在检测基因或基因组改变的可信性，先用正凡人对正凡人的构造举行比拟试验，效果没有缺失或扩增的信号出现。而在膀胱癌患者的构造中检测到了显着有扩增或缺失的信号产生。而

7、这些缺失或扩增的部位，含有相应的癌基因或抑癌基因。证实此要领在检测基因扩增或缺失中，得出的效果是可信的。1.4Array-GH的特点Array-GH技能具有两方面显着上风：敏捷度和正确性：由于染色体DNA以高度麋集和超螺旋的情势存在着，因此传统GH只有在DNA序列缺失达10b20b细胞株或20b30b原发肿瘤以上或序列扩增时扩增子与扩增拷贝数之积至少2b才被检测出来。故传统GH所提供的信息中一定包罗有为数浩繁的基因，必要作进一步的正确定位。Array-GH避开了庞大的染色体布局，所杂交的靶序列仅为包罗了少数基因的短DNA片断，以是能寻出传统GH检测不出的DNA序列拷贝数的差异，并同时将扩增或缺

8、失的范畴正确地定位在某个或某几个基因或未知基因上。主动化、步伐化：染色体带型的庞大性和个别差异决定了核型阐发不成能全部实现机器化，必需依赖履历富厚的细胞遗学家对核型阐发软件得出的效果举行校正后才气进一步阐发基因组的不服衡性。因此传统GH的技能受报酬因素的限定，必要一定的履历技能和劳动力支持。Array-GH技能中不必要染色体核型的制备和阐发，与平凡的基因芯片检测表达谱的历程一样，其效果完全可以由呆板和盘算机综合阐发后即可得到样品中大量基因序列及表达的信息。1.5Array-GH技能的分类根据微阵列上所固化的核苷酸的性子，Array-GH可分为DNAArray-GH和DNAArray-GH两种范

9、例。前者以通例的DNA微阵列为平台，基因芯片外貌结实的探针来自待测种属的DNA文库。DNAArray-GH技能使得大范围、高通量研究基因的改酿成为实际。DNAArray-GH技能是直接将基因组DNA片断固化于芯片外貌，因此靶序列上不单有基因编码区，还包罗了内含子、重复序列、其他调控序列等非翻译区，增长了实行效果的信息量。同时由于基因组DNA片断长于DNA片断，因此DNAArray-GH的杂交信号强于DNAArray-GH，进步了实行的敏感度。但DNAArray-GH芯片制备相对轻易，而DNAArray-GH芯片上普及漫衍的表达序列标签也有助于所得序列进一步纯化和点阵。因此这两种Array-GH

10、技能各有所长，在实际事情中可根据详细环境和实行要求作出选择。2Array-GH技能在肿瘤研究中作用Array-GH应用超高密度和长寡核苷酸探针，对多种肿瘤相干染色体地区的DNA拷贝数变革具有较高的区分率，从而可以寻出基因组的改变，并可精致到基因和外显子程度的改变；也可以检测到很小范畴的基因扩增和缺失以及小于500碱基对的染色体断点位置。该技能最新希望，Niblegene公司研制的芯片,在一芯片上含有385000个探针，一次可以阐发成千上万个基因组的变革，乃至可以确定相干基因并提供正确的定位1214。2.1乳腺癌2.2肺癌le等20利用Array-GH技能阐发了14例小细胞肺癌和27例非小细胞肺

11、癌基因在各细胞周期调治中的作用，创造小细胞肺癌中RP5基因表达加强，p38APK活化基因上调，而在非小细胞肺癌中表示为DKN2A基因下调，APK9和EGFR基因上调。这些信息表白小细胞肺癌和非小细胞肺癌在细胞周期调控中有差异的基因调控机制。2.3血液及淋巴体系肿瘤已有研究证实，人类染色体3p在很多实体瘤中有基因缺失环境产生，而没有数据表白它在布满大B细胞淋巴瘤中有基因缺失环境产生，Kaeka等21应用Array-GH技能对布满大B细胞淋巴瘤举行研究时创造，约莫30的布满大B细胞淋巴瘤患者的基因在3p14.2上有缺失。全部这些基因缺失被确定在FHITFragileHistidineTriad基因

12、片断内，并表白FHIT基因的缺失是引起基因突变的缘故原由之一。vanVlierberghe等22利用Array-GH技能对儿童急性T淋巴细胞白血病举行研究创造，儿童急性T淋巴细胞白血病33基因在9q34有扩增。而且这个地区有4b，内含NTH1基因，9q34的扩增导致很多基因过表达，此中包罗RLP41，SSNA1和PHPT1基因的过表达。只管这些基因的扩增和表达不克不及完全明白与患者的不良预后有关，但该基因的复制标识表记标帜着肿瘤细胞化疗后的存活。2.4前线腺癌ihael23及lssn等24研究创造PSA基因定位于13q地区转录在19号染色体上，整个长度为6kb。他们对整个长度的基因举行阐发证实

13、同系的KLK1、KLK2和HK基因家属表达高达7080。而PSA基因又被称为KLK3基因。vanDuin等25利用ArrayGH技能创造前线腺癌构造或细胞中8q上有5个地区8q21.13(8182b)，8q22.1(9496b)，8q22.23(101103b)，8q24.13(124126b)，和8q24.21(127129b)高频率的扩增，而这些地区大部门远端都有含有Y癌基因。Y和别的地区的别的13条与癌相干基因在前线腺癌构造中用Array-GH法也被检测到。尚有前线腺癌异种移植的P339中，通过Array-GH检测到8q上高扩增的两条基因。用定量RT-PR检测肿瘤构造、正常构造、前线腺癌

14、细胞和异体移植的前线腺癌构造中这16条基因的表达，创造这16条中有3条高表达，这3条基由于，PDP定位于8q22.1(95b)、PABP1定位于8q22.3(102b)和KIAA0196定位于8q24.13(126b)。这些基因被以为是前线腺癌希望的标识表记标帜物。2.5其他肿瘤比来，日本学者Sait26用Array-GH法对7个胆囊癌细胞系和5个胆管癌细胞系的染色体改变举行了检测，效果创造，在7个胆囊癌细胞系中，每一个都可以检测到6p21.32扩增，均可检测到的丧失区在3p22.3，3p14.2，3p14.3，4q13.1，22q11.21，22q11.23，而在5个胆管癌细胞系中，均可检测

15、扩增的是7p21.1，7p21.2，17q23.2，20q13.2，丧失的在1p36.21，4q25，6q16.1，18q21.31，18q21.33，而扩增最大的地区却在13q14.3q21.32(约莫11b)，丧失的最大地区在18q12.2q21.1(约莫15b)，表现出胆囊癌和胆管癌遗传学差异。有学者还利用ArrayGH技能研究了胰腺肿瘤27、宫颈癌28、胃癌29等多种肿瘤，刻画了相干染色体地区的DNA拷贝数及基因变革，富厚了分子生物学信息。3在肿瘤研究及应用中存在的题目因Array-GH可以举行主动化操纵，具有高通量、轻便、正确的特点，故可应用于临床诊断。Array-GH的区分率高，可以或许创造同一肿瘤差异亚型之间的