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1、 聚合酶链式反应 目录 PCR定义 PCR发展简史 PCR技术原理、工作原理 工作步骤 PCR的反应特点 PCR的主要作用 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR的定量方法PCR定义聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊

2、断或任何有DNA、RNA的地方。PCR发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得

3、到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。PCR发展简史最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。由于PCR方法被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的D

4、NA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。PCR工作原理PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成模板DNA的变性：模板DNA经加热至9095一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5560，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与

5、半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，13小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。工作步骤标准的PCR过程分为三步： 94（预变性）4min 94（变性）4min 36（退火）1min 72（延伸）1.5min 72（延伸）5min 4保存PCR的反应特点 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低 PCR的主要作用1、基础研究方面应用 扩增目的基因和鉴定重组子 ；克隆基因； 基因功能和表达调控的研究；基因组测序 ；制备单链模板 。2、PC

6、R在临应上的应用 检测病原体； 在基因分型中的应用 ； 在遗传学上的应用 ； 在肿瘤研究中的应用 3、在法医学中的应用 法医学个体识别； 亲子鉴定。实时荧光定量PCR原理 指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化来即时分析目的基因的拷贝数目，通过与加入已知量的标准品进行比较，可实现实时定量。 PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。标本的运送 标本采集后，应尽快送至检测实验室。采集后的所有样本在送至实验室之前，均应暂放在28临时保存。靶核酸为DNA的标本，如为无菌条件下采

7、集，可在室温下8小时内运送。靶核酸为RNA的标本，短时间内的运送（如10min左右），可在室温下运送；如时间较长，则应在加冰条件下运送。如在标本中加入了适当的稳定剂（如GITC）的血标本，则可在室温下运送或邮寄。靶核酸为RNA的标本，采集后建议在4h内送至实验室。标本运送过程中应充分考虑生物安全问题。有合适的容器转运标本，带盖的透明转运盒，有生物危害标识。标本的验收采样质量评价血清（浆）标本：体积不少于2ml。观察是否溶血、脂血、黄疸及其程度。严重溶血：血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。严重黄疸：胆红素可抑制Taq酶活性。脂血：低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作

8、用，故对Real Time PCR有干扰。从细胞组成、所需类型细胞的数量进行评价泌尿生殖道分泌物标本可以显微镜下观察是否有上皮细胞存在。痰液标本：体积不少于5ml。外观规定脓样、血性、干酪样及脓性粘液样痰为合格。镜下用油镜观察白细胞大于10个。 阈值与CT值 荧光阈值 是指在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准（即PCR扩增产物量的标准）。为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在荧光扩增曲线上认为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上。一般荧光阈值设置为315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。threshold = 10 SDcycle 3-

9、15 循环阈值（Ct） 即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数。阈值线扩增曲线S型曲线的四个特征性阶段线性基线期：指PCR反应处于起始阶段。此阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低，反应系统背景情况。指数扩增期：指PCR达到最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环后，PCR产物呈指数倍增加。线性增长期：指PCR达到稳定的线性扩增阶段，PCR产物呈几倍数增加。平台期：由于原料消耗殆尽，扩增减缓，荧光信号不再随循环数增加而增加。PCR曲线扩增对数图PCR实验室设置与管理实时荧光定量PCR技术作为临床基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本

10、处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。各区标签颜色：红色（第一区）、白色或绿色（第二区）、蓝色（第三区）；专用工作服：粉红色（第一区）、白色（第二区）、蓝色（第三区）。标本的接收则在实验室标本接收处进行。各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。严格遵守从“试剂准备区标本处理区扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。非本实验室工作人员，未经许可不得入内 。PCR实验室的仪器配置试剂贮存与准备区：超净工作台、-20冰箱、微型离心机、混匀器、加样枪（1-1000UL）、紫外线灯、消耗品、一次性手套、耐高温处理的离心管及加样枪器头、专用工作服、专用办公品、干湿温度计等。标本处理区：安全生物柜、高速台式离心机、恒温水浴或恒温金属浴（100 ）、离心机、紫外线灯、消耗品、一次性乳胶手套、耐高温处理的离心管及加样枪器头、专用工作服、专用办公品、干湿温度计等。扩增分析区：荧光扩增仪与电脑、消耗品、专