(完整版)m6A甲基化研究方法

1、( 完整版)m6A甲基化研究方法RNA 甲基化修饰(m6A ）研究思路及方案设计甲基化修饰约占所有修饰的以上，而甲基腺嘌呤是高等生物和lcs上最为普遍的修饰。目前发现icrocirc, rtA 和so上都有发生6A修饰.6A 修饰主要发生在序列中的腺嘌呤上，其功能由编码器 (riter ”消码器 (rser)和读码器(eer决定1编码器(riter)即甲基转移酶, 目前已知这个复合物的成分有 ， 14和1429而和作为去甲基酶（消码器)可逆转甲基化；6由6结合蛋白识6（读码器有（包括123和2和核不均一蛋白家族（P21P。m6A酶系统METTL3是早先被鉴定为结合 SAM的组件，其缺失引起小鼠

2、胚胎干细胞、Hela 细胞和 HepG2 细胞中 m6Apeaks的减少及其同源蛋白1（cler secle)上，显示修饰可能和的剪切加工相关与31二聚体相互作用，并共定位于目前已发现 FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相核小斑，影响甲基化效率，参与 剪。而 142作为候选的甲基转移酶复合体的新亚基，是整体甲基化进程所必须的家族的成员，作为第一个被发现的去甲基酶结合能力目前已发现 FTO调节异常与肥胖、大脑畸形和生长迟缓相关，揭示6可能对这些疾病具有重要的调节功能4-6是家族中被发现具有去甲基作用的另一个成员, 以seA敏感的方式与核小斑共定位，它可直接催化 6甲基化腺苷去除甲基而不同于

3、O的氧化去甲基7.此外和它的去甲基化活性影响新生合的成和剪切效7，且敲除雄性小鼠表现出精子发生异常，这可能是精子发生相关基因表达改变的结果76A修饰执行其功能主要通过两个途径： 精细调控甲基化转录本的结构,以阻止或诱使蛋白相互作用;或被直接由m6A 结合蛋白识别，诱发后续反应。目前一类含有 功能结构域的蛋白被鉴定为 m6A修饰的结合蛋白. 其中1,2 3,1和己被证实是的结合蛋白.1 主要影响修饰基因的翻译主要影响修饰基因的降解，而 结合修饰的基因后影响其剪接。C一种丰富的核结合蛋白,参与re的加工8且研究表明P通过6与A结合调控目标转录本的丰度和选择性剪切( 完整版)m6A甲基化研究方法图1

4、 m6A 修饰的酶系统10 m6A生物学功能越来越多的证据表明 m6A修饰在哺乳动物中发挥重要的生物功能。例如，在转录后水平上调控 RNA的稳定性11、定位12、运输、剪切13和翻译14。. pri-miRNA甲基化，会的成熟15 识别蛋白促进pri-miRNA 加工成pre-miRNA 16的翻译17。修饰在基因表达调控中起着重要的作用 , 其调控机制的异常可能与人类疾病或癌症相关 . 目前发现 m6A可能会影响精子发育（53tc（3（诱导的损伤反应(，、肿瘤生成（2 或转移（1干细胞更新（ 脂肪分化(FTO)、生物节律、细胞发育分化、细胞分裂及其它的一些生命过程。例如敲除的雄性小鼠增加了中

5、的(）A修饰，其特点是凋亡影响减数分裂中期的精子细胞,引起生育能力受损。和1增加弱精症精子的 水平18 ，在生殖细胞中的敲除严重抑制精子分化和减数分裂的发生，转录组和 分析显示精子发生相关基因的表达和选择性剪接发生了改变1。可促进靶基因的翻译效率,并降低其的丰度, 在精子发生过程中起关键作用。当减数分裂开始时表达上调敲除小鼠的生殖细胞没有经过偶线期的发育导致小鼠不育20在损伤反应中可促进聚合酶（Pol ）与核酸 剪切修复途径快速定位到引起的损伤位点，当缺失时，细胞无法迅速修复照射引起的突变, 并且对照射更加敏感25在淋巴细胞性小鼠过继转移模型中ettl3缺陷通过影响6修饰,( 甲基化研究方法降

6、低家族衰减,增加L7介导的5 活性和T细胞内稳态增殖和分化，进而抑制肠炎的发生2。在肝癌中，1通过调控ri-iA的6修饰,影响i-126的生成加工，从而抑制肝癌的转移22 的表达, 而过表达降低了的6修饰，从而稳定提高的表达水平，最终增加乳腺癌干细胞所占的比例23。 此外， 低氧诱导乳腺癌细胞中依赖21的和4 的6A甲基化抑制5 除显著降低免疫缺陷小鼠乳腺癌的肺转移24能够促进肺腺癌细胞的生长、生存和侵袭，但还不清楚它是否作为 m6A 调节器或效应器发挥作用25 。在急性髓细胞白血病) 者中，m（6A 调控基因的突变或拷贝数变化与 突变存在密切联系，且 m（6）A 调控基因的改变与不良预后相关

7、26 。此外，在中高表达，它通过降低转录本中的（）水等靶点的表达，增强了白血病癌基因介导的细胞转化和白血病形成，并抑制全反式维甲酸(诱导的细胞分化27. 表达与635通过lcA介导基因re上的6修饰维持胶质瘤细胞的成瘤性2。此外, 甲基转移酶或1的敲除, 能够改变6的富集和9大地促进了胶质瘤细胞的生长、自我更新和肿瘤形成 29.表达，极图 2 m6A RNA修饰和介导的功能30m6A的研究方向主要是通过研究m6A 修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能，进而研究 修饰的生物学功能和作用机制: 酶分子, 研究下游功能基因分子的表达和 介导相关基因异常（调控影响细胞表型和功能特征。( 完整版

8、)m6A甲基化研究方法修饰图谱构建及作用机制：通过甲基化测序 ）构建疾病细胞模型或者发病组织的m6A 修饰谱分析的motif, 数量及分布,Peak关联基因的特征,联合研究 m6A甲基化与表达的关系。研究思路研究方案( 完整版)m6A甲基化研究方法疾病样本 VS 正常样本m6A修饰图谱分析m6A修饰差异基因分析差异表达基因m6A 修饰特征分析差异表达基因关联分析方案一验证( 甲基化研究方法 等 数据库 筛选异常 表达 的m6A 相关基因（ 疾病vs 正常）临床样本qPCR验证目标基因肿瘤细胞中干扰目标基因MeRIP-Seq等检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移筛选下游基因方案二验证目标基因通调控下游

9、基因研究案例研究案例一 （ m6A修饰图谱分析）( 完整版)m6A甲基化研究方法SKlein-HitpassHorsthemkeN6-adenosine methylation in is PoSe2015 ，10(2 ：e011843。在许多不同种类的 中，都已观察到 6 - 腺苷（6）的甲基化，但其在 icros中还没有被研究。研究者在 1，24 和33 细胞系中，通过敲除 6甲基转移酶 筛选到表达差异的 icro,microRNA敲除对甲基化的的稳定状态的影响。研究案例二（机制研究J，g ou , iu ，n Jg , ，u ,oun : resses the metastatic po

10、tential ofhepatocellular carcinoma modulating -methyladenosine-dependentprimary MicroRNA processing。 Hepatology 2017， 65（2) ：529-543。, 修饰是否参平在肝癌中下调。为研究哪些因子导致 在肝癌的下调，作者在 20 例肝癌及癌旁中检测 甲基化酶和去甲基酶的表达， 130作为肝癌预后因子，细胞实验发现其敲除可增强肝癌转移。接下来作者研究 抑制肝癌转移的机制，由于已有研究显示 m6A修饰能够增强 蛋白识别，促进pri的表达发现m6A相互作用且敲除11通过6修饰促进识别ri

11、 i12。( 完整版)m6A甲基化研究方法修饰促加工，从而抑制肝癌细胞转移。图 11在肝癌中下调图 21依赖的6通过 G8126 加工研究案例三( 机制研究）IF=27。4控 iSLinSZ YEP,XieKO etal: Demethylase Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells Sustaining FOXM1 ExpressionCellProliferationProgram。CancerCell2017, 31(4) e596 。甲基化异常是胶质瘤的表观遗传调控因子，但甲基化在肿瘤包括恶性胶质瘤（中的调控还

12、尚未清楚。为研究6调节可能导致患者临床疗效不佳，作者通过数据库，发现恶性胶质瘤样干细胞制 s增殖，进一步体内验证敲除 可抑制肿瘤生长。为研究的66seq 筛选到胶质瘤增殖相关的最后通过P、 、免疫荧光、核质分离/PP和e等实验证明通过去甲基化初期转录本调节在 中的表达。1 作用是否受其他因子的调节邻近基因，发现 lncRNAFOXM1-AS与序列互补，且共表达、共定位, 进一步通过P，Allon等实验证明lcA1-进和初级转录本的相互作用。最后通过细胞实验进一步验证 在lcA1 S的1 的干性。( 完整版)m6A甲基化研究方法图1 ALKBH5敲除细胞中m6A修饰的特征和基因表达的变化。Gen

13、eexpressionregulationmediatedthroughreversible m(6)A NatRevGenet15(5)：293-306。crtz chJooic ,，cig , sin ertis，er esn N，CacchiarelliDetal: Perturbationofm6Awritersrevealstwodistinctclassesofmethylationinternal5sites. CellRep2014, 8(1）:284。3.YXW, WJetalFTO-dependentdemethylation of N6-methyladenosine r

14、egulates splicingisrequiredfor iogeesis 。elles2014, 2（1：1403-1419.。JiaX，Li Q，BaileyNobregaMA etal:F-eiteortion of 6-roetleosiedorleosie in li.Nat。CommunC，MeyreDKornerA，JacobsonP,CarlssonKiessWV ，LecoeurCetalVariationincontributestochildhoodobesitysevereadultobesity。NatGenet39(6)：724726.BoisselS，Reis

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