阴虚内热证红斑狼疮外周血单一核细胞BCL2基因家族动态研究

1、阴虚内热证红斑狼疮外周血单一核细胞BCL-2基因家族动态研究【摘要】目的研究激素滋阴清热方治疗前、中、后阴虚内热证红斑狼疮SLE外周血单一核细胞PB凋亡相关BL-2基因家族的动态表达。方法阴虚内热证SLE患者治疗前、中、后三次及安康对照组外周血单一核细胞基因表达谱芯片检测，对BL-2基因家族成员数据进展分析。结果找到BL-2基因家族基因16个，其中BL-2、BAG3治疗前、中、后均明显下调，而BAG1、BL6、BLA21治疗后表达均上调。结论阴虚内热证SLE患者PB存在BL-2基因家族凋亡基因的异常，激素与滋阴清热方治疗后抑制/促进凋亡的BL-2基因比例发生明显改变，细胞凋亡减少。BL6可能是

2、中医药等治疗SLE的靶基因之一。提示研究不同证型SLE治疗前后T、B淋巴细胞亚型的凋亡情况及凋亡机制，是合理评价凋亡在SLE发病及诊治中的作用的关键。凋亡基因的调控可能是滋阴清热方实现阴平阳秘的内在机制之一，有待深化研究。【关键词】阴虚内热证；系统性红斑狼疮SLE；BL-2；细胞凋亡Abstrat：bjetiveTstudythedynaiexpressinftheapptsis-assiatedBL-2genefailyintheperipheralbldnnulearells(PB)ftheheatdefiienypatientsithlupuserytheatsus(SLE)befre,

3、duringandaftertreatentithhrneandZiyinQingrefrula.ethdsBefre,duringandaftertreatent,peripheralbldnnulearellsftheSLEpatientsith“Yinastheniageneratingintrinsiheatereseparated,thenDNAirarrayhipasusedtanalyzeandpardithahealthyntrlgrup,inthispart,thedatafBL-2genefailyebersereseletedutandanalyzed.Results16

4、BL-2failygeneerefund.TheexpressinfBL-2andBAG3eresignifiantlyreduedbefre,duringandaftertreatent,hiletheexpressinfBAG1,BL6andBLA21asinreasedaftertreatent.nlusinAbnralitiesfBL-2failygeneinPBfSLEpatientsith“Yindefiienyheaterebserved.ApptsissuppressinandprtingenefBL-2failyerehangedbythehrnesandZiyinQingr

5、efrulatreatenthihledtreduingapptsis.BL6aybenefthetargetgenehihasaffetedbythetreatentfhineseediine.TstudythedifferentsubtypesapptsisandapptsisehanissfTandBlyphytefSLEithdifferentsyndrepatternbefreandaftertreatentisveryiprtantfrestiatinntherlefapptsisinSLEpathgenesis,diagnsisandtreatent.Regulatinfappt

6、tigenesaybeneftheehanissfZiyinQingrefrulatahieveYinandYanginarelativeequilibriu.Keyrds：Yinastheniageneratingintrinsiheat;Systeatilupuserytheatsus(SLE);BL-2;ApptsisSLE是多基因相关的自身免疫性系统性疾病，发病与细胞异常凋亡亲密相关。BL-2/Bax是诱导细胞凋亡的通路之一。Bax是BL-2癌基因家族中可以促进细胞凋亡的蛋白，BL-2是可以抑制细胞凋亡的蛋白，两者的比值决定细胞凋亡与否，当Bax多时，细胞凋亡，否那么凋亡延缓1。BL基

7、因家族中其它基因也与细胞凋亡亲密相关。阴虚内热证是SLE的最常见最根本的证型。广东省中医院皮肤科多年应用滋阴清热方治疗阴虚内热证SLE获得良好效果，我们研究阴虚内热证SLE中医药治疗后BL基因家族表达的动态变化，试图从基因程度讨论其现代分子机制。1临床资料2研究方法2.1治疗方法2.1.1中药治疗滋阴清热方(狼疮号)，5粒/次，3次/d口服。局部病人阴虚内热症候比拟明显时，短期配合使用滋阴清热方汤剂，加强滋阴清热成效。2.1.2一般治疗及对症处理保护胃粘膜、补钾、补钙、抗感染。西医药除激素外，只根据患者激素用量配合使用泰胃美、雷尼替丁保护胃粘膜。2.1.3激素治疗所有病例均维持纳入时的激素用量

8、，最高不超过25g。疗程3个月。2.2表达谱基因芯片实验方法分别于治疗前、治疗中6周和治疗后12周采静脉血别离提取淋巴细胞，然后按基因芯片技术要求提取总RNA，70保存备用，按完成3个月疗程的先后顺序送检9例患者的27个样本和10例正常人样本，其中4例患者至少有一次样本不符合基因芯片实验要求，最后选择了3次样本均合格的5例患者的15个样本及正常对照组10个样本，首先对样品进展体外扩增处理，随后对扩增后的RNA样品采用反转录标记方法掺入Y3荧光分子，每个样品完成一张GS芯片人类基因表达谱芯片由微芯生物公司采用DNA直接点样消费，共点有8064个基因点，其中7458个为表达基因片段实验。2.3数据

9、处理与统计分析比值Rati表示荧光信号通过LESS方法归一化后，基因表达量在实验组对照组和对照组实验组间的变化倍数大于1的数值代表相应基因表达量上调的倍数，小于1的数值那么代表相应基因表达量下调，其倍数那么用1除以该数值后的负数来表示。按两个样品信号强度间的比值Rati大于2或小于0.5的数据作为表达有显著性差异的基因数据。用SPSS13.0软件将16个BL基因家族成员基因前、中、后3次表达与正常人的表达的比值Rati进展重复测量方差分析和多元方差分析，两两比拟用SNK法。转贴于论文联盟.ll.3结果BL基因家族与细胞凋亡等亲密相关，我们对16个BL相关基因进展分析，总体3次表达无差异P=0.

10、560，而不同基因间有显著性差异P=0.000，测量时间与不同基因间存在交互作用P=0.014，说明不同基因在不同时间有差异表达。从图1可以看到BL2、BAG3治疗前、中、后均明显下调，而BAG1、BL6、BLA21治疗后表达均上调，两类基因间表达有统计学差异P0.05，但同一基因间两两比拟差异无统计学意义P0.05，与孙保东等3的研究类似。4讨论细胞凋亡与SLE发病亲密相关，细胞凋亡在SLE发病中的作用研究观点不一，淋巴细胞异常凋亡导致自身抗原的产生或者细胞凋亡可去除自身反响性细胞的观点不一。本研究中发现许多凋亡相关基因表达与正常人有差异，治疗前后都有抗凋亡与促凋亡基因表达的上调或下调。BL

11、-2基因家族在凋亡的调控中有重要作用，其中抗凋亡的有：BL-2，A1，BL-xl，BL-，l-1，促进凋亡的有Bax，Bak，Bad，Bid，Bi，Bik，BNIP34。研究证实BL-2通过与Bax结合抑制凋亡,Bad通过与Bl-2的结合置换Bax,bax/BL-2比例可调控凋亡的发生：BL-2程度高于Bax时，细胞对凋亡不敏感，反之细胞易于凋亡。Bax在安康细胞中以单体形式存在于细胞质内，当受到相关的凋亡信号刺激时会转移到线粒体上，直接或间接地与线粒体通道蛋白作用，引起细胞色素的释放。Bad的BH3域可以与BL-2家族在线粒外膜结合而使之灭活，从而促进凋亡的发生。我们的研究发现抑制凋亡的BL

12、-2基因表达程度治疗前、中、后均显著低于正常人的表达，而BAG1基因也是抗凋亡基因，治疗前接近正常人，治疗3个月后升高，BL2A1也是抗凋亡基因，治疗后显著升高。而促进细胞凋亡的基因BAX、BAK1治疗前高于正常人，治疗后接近正常人。可见治疗前Bl-2/Bax比值显著低于正常，提示SLE通过BL-2/Bax细胞凋亡途径促进外周单一核细胞的凋亡，与张丽霞5的研究发现相一致。治疗后BL-2/Bax升高，提示治疗后外周单一核细胞的凋亡减少，与温成平等观察到解毒祛瘀滋阴药治疗后的BL-2/Bax比值升高相一致6。原癌基因BL6编码一种DNA结合蛋白，为一核转录因子，其功能是调节淋巴结生发中中心B细胞的

13、分化与发育成熟，生发中心B细胞表达BL6，分开生发中心后停顿表达。BL6可抑制P53在生发中心B淋巴细胞的组成型表达而保护因DNA损害诱导的凋亡7。有研究认为，缺乏BL6表达的B细胞虽可以在脾脏中分化成Ig和IgG1记忆B细胞，但很少在骨髓中分化成长寿的能分泌IgG1抗体的B细胞8。BL6治疗3个月后表达显著上调，提示治疗后B细胞较多从淋巴结生发中心释放到外周血中，这可能与治疗后外周异常克隆B淋巴细胞被去除，而生发中心的正常B淋巴细胞因BL6表达的进步而凋亡减少且分化发育成熟加快，从而转移到外周血中以发挥正常的功能。提示BL6可能是中医药等治疗SLE的靶基因之一，有待进一步深化研究。众多研究发

14、现SLE患者常常同时有抑制凋亡和促进凋亡的基因的表达上调或下调，治疗前细胞凋亡增多，为什么反而有大量异常B淋巴细胞克隆增殖，产生大量自身抗体，而治疗后，外周单一核细胞凋亡减少，而不是促进异常B淋巴细胞的凋亡，令人费解。对于这一困境的思索，我们认为很可能不同类型的T、B淋巴细胞在SLE发病的不同阶段、治疗前后其凋亡率有很大的差异，这种差异可能来自不同细胞的凋亡机制存在差异，这与从这些看似矛盾的研究结果来看，可能并不矛盾，而是我们对细胞凋亡的机制研究仍不够深化。SLE外周血淋巴细胞抗凋亡的基因表达降低而促进凋亡的基因表达增加，促进淋巴细胞的异常凋亡，进而释放更多的自身抗原入血，驱动B细胞产生自身抗

15、体。治疗后BL相关基因家族中抗细胞凋亡基因上调与促凋亡基因下调，外周单一核细胞凋亡减少，可能与治疗后异常T、B淋巴细胞已被渐渐去除，正常B细胞较多从淋巴结生发中心释放到外周血中，且正常T、B淋巴细胞的凋亡减少。我们认为，分析研究不同证型SLE治疗前后T、B淋巴细胞亚型的凋亡情况及凋亡机制，是合理评价凋亡在SLE发病及诊治中的作用的关键。中医药治疗似乎在调节细胞凋亡方面有着独特的作用，可以使各种细胞的凋亡到达新的平衡，这也许是中医辨治到达阴平阳秘的现代机理之一。【参考文献】1TaXJ,TillyKI,aravEiDV,etal.Differentialexpressinfebersfthebl-

16、2genefailyinprliferativeandseretryhuanendetriu:glandularepithelialellapptsisisassiatedithinreasedexpressinfbaxJ.JlinEndrinletab,1997,82:2738.2赖梅生滋阴清热方对阴虚内热证SLE淋巴细胞基因及蛋白表达谱的动态影响D广州中医药大学博士学位论文，2022：6.3孙保东，沈南，裴军，等SLE病人外周血白细胞Bl22和Bl2XRNA表达研究J上海免疫学杂志，2000，204：239.4周桔，罗荣保，汤长发，等Bl-2蛋白家族和p53基因在细胞凋亡中的调控效应J中国组织工程研究与临床康复，2022，1110：1950.5张丽霞，郑京，洪江淮热毒炽盛型SLE与肾小球Fas、BL-2、Bax蛋白表达J中医药学刊，2022，21(9):1518.6温成平，曹灵勇，王新昌，等解毒祛瘀滋阴药对SLE患者Bax/Bl22基因RNA表达的影响J浙江中西医结合杂志，2022，176：333.7F